超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁

工作商报

DOI ： 10.11973/lhjy-hx201911008

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者

尿液中尼古丁和可替宁

李晶、梁梦洁2,刘欣\\王晋、黄海涛、许永\\李雪梅\\

杨光宇\\孔维松\\杨叶昆h

(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明650106; 2.昆明医科大学药学院，昆明650504)

摘要：吸烟者尿液样品用自主研究开发设计的前处理萃取瓶处理，采用超高效液相色谱-串联

质谱法快速测定萃取液中尼古丁和可替宁的含量。以Waters ACQUITY UPLC BEHHILIC色谱 柱（50 mmX2.1 mm, 1.7 pm)为固定相，以含0.1%(质量分数）氨水的甲醇（6 + 4)溶液为流动相， 串联质谱中采用正离子模式监测。以D4-尼古丁和D3-可替宁为内标物，尼古丁和可替宁的线性范 围均为 20.0〜2 000 pg • L_1，检出限（3S/N)依次为 5.7,3.7

2.9%〜3.4%，日间相对标准偏差（《 = 7)为3.2%〜3.6%。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；尼古丁；可替宁；吸烟者；尿液中图分类号：0657.63

文献标志码：A

文章编号：1001-4020(2019)11-1287-05

. L-1。在 2.0,4.0,8.0 pg 等 3 个

浓度水平进行加标回收试验，回收率为93.6%〜112%，测定值的日内相对标准偏差（w =7)为

目前吸烟与健康是世界最受关注的公共卫生问 题之一，而科学测量烟草暴露是研究烟草暴露与健 康相关性的基础[12]。尼古丁及其代谢物可替宁是 评价烟草暴露的关键生物标记物，可通过尿液、血 液、唾液和头发等生物材料中尼古丁和可替宁的测 定来评估人体烟草暴露的剂量和程度。尿液样品采 集方便，对受试者侵害性小，是供吸烟与健康研究最 理想的生物样品〜]»因此建立准确、快速测定吸烟 者尿液中尼古丁和可替宁的分析方法对吸烟与健康 研究具有重要指导意义。

目前国内外对尼古丁和可替宁的测定方法主要 有酶联免疫法（ELISA )[5]、气相色谱法（GC- MS)[67]、高效液相色谱法（HPLC)和液相色谱-质 谱法（LC-MS/MS)11811]。其中，ELISA受到基体干 扰以及试验操作影响较大，而GC-MS由于要从水 相的尿液中进行分离提取目标物，前处理操作较为 复杂，因此HPI.C和LC-MS/MS是最常用的方法。 和传统的LC相比，LC-MS/MS具有更高的灵敏度 和选择性。无论是HPLC还是LC-MS/MS，样品 *

收稿日期：2018-07-12

基金项目：云南中烟工业有限责任公司科研项目（2018JC09) 作者简介：李晶，博士，主要从事烟草烟气代谢分析工作* 通信联系人。yangyekun@163.com

前处理操作需经样品萃取、离心分离、过滤等步

骤[^2]，操作较为繁琐，因此需要建立快速、便捷 的前处理方法。

本工作设计了一个能快速进行前处理样品的样 品萃取瓶，大大简化了样品前处理操作，提高了前处 理效率，减少误差。本工作利用超高效液相色谱-串 联质谱法对吸烟者尿液中的尼古丁和可替宁进行测 定，目的在于为烟草暴露生物标记物的快速准确测 定提供有效技术支持。

1

l.i

试验部分

仪器与试剂

ACQUITY UPLC型超高效液相色谱系统，配

二元梯度栗、柱温箱和自动进样器、API-4000型三 重四极杆串联质谱检测器和Analyst 1.5工作站。

混合标准储备溶液：1.000 g • L—1，称取尼古丁 和可替宁标准品各0.100 0 g，用甲醇溶解并定容至100.0 mL，于一20 X：下保存。

内标储备溶液：0.50 g • L—1 ,称取D4-尼古丁和 D3-可替宁各0. 050 g,用甲醇溶解并定容至100.0 mL〇

内标溶液:5.0 mg • L_1，移取0.50 g • L_1内标 储备溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容

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李晶，等：超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁

至刻度。

混合标准溶液：1〇.〇 mg • L—1，移取1.000 g • L一1混合标准储备溶液1.0 mL至100 mL容量瓶 中，用甲醇定容至刻度。

甲醇为色谱纯，氨水为分析纯，试验用水为超 纯水。

1.2仪器工作条件

1)

10.0 mL(控制样品介质中甲醇的体积分数约为 60%)。把萃取瓶的内套管卡在外套管的口部（c)并 充分摇匀，然后把萃取瓶的内套管向下压，萃取溶液 就通过滤筛板进人到内套管中，并从内套管中的细 弯管流出，达到样品过滤和直接转移的效果（d)。从 细弯管口收集萃取液，弃去最初的2〜3 mL，然后用 色谱进样瓶直接收集1.0〜1.5 mL的萃取溶液，按

Waters ACQUITY UPLC仪器工作条件进行测定。

色谱条件

BEHHILIC色谱柱（50 mmX2.1 mm，1.7 pm),柱 温30

流动相为含0.1 %(质量分数，下同）氨水的

甲醇（6 + 4)溶液；流量0.5 mL . min—1 ;进样体积5.0 fxL〇

2)

模式（ESI+);多反应监测扫描方式；电喷雾电压

5 000 V;雾化气压力348 kPa，气帘气压力209 kPa,

2结果与讨论

2.1色谱行为

按仪器工作条件对混合标准溶液和内标溶液进

多反应监测色谱图见图2。质谱条件质谱电离方式为电喷雾正离子行 测定，

2

辅助加热气压力348 kPa;脱溶剂温度500 °C;碰撞 电压28 V，去簇电压30 V;驻留时间100 ms。尼古 丁的定量离子对的质荷比（m/z)为163.1/117.2; D4-尼古丁的定量离子对m/z为167.1/121.2;可替 宁的定量离子对w/z为177.2/80.2;D3-可替宁的 定量离子对m/z为180.2/83.2。1.3试验方法

对9名志愿者按照抽吸习惯进行分组，重度抽 吸者每人、每天25〜50支，中度抽吸者每人、每天 15〜25支，轻度抽吸者每人、每天5〜15支，分别收 集每位志愿者的尿液于容器中，待处理。

自制的样品萃取装置见图1。

12

1 一尼古丁；2 —可替宁 (a)

混合标准溶液

1 —D4-尼古丁；2_D3-可替宁

(b)

图2Fig. 2

a—样品瓶；b_过滤筛板；c—样品萃取；d—样品过滤和转移

图1

Fig. 1

样品萃取装置

内标溶液

多反应监测色谱图 MRM chromatograms

2.2仪器工作条件的选择

尼古丁和可替宁为极性小分子，普通的液相色 谱柱保留较弱，不容易分离。根据二者的极性，采用 亲水作用色谱柱[11]，尼古丁和可替宁均可得到较好 的保留和分离。试验选择Waters ACQUITY UPLC BEHHILIC 色谱柱（50 mm X 2. 1 mm,1.7 ym)为固定相，含0.1%氨水的甲醇（6 + 4)溶液 为流动相，流量为O.SmL.mirT1。在上述条件下，

Extraction device for sample

由图l可知：该样品萃取装置由两部分组成，包 括带密封圈的外套管（a)和带0.45 jum过滤筛板的 内套管（b)。采集吸烟者尿液样品后，移取1.0 mL 尿液样品于萃取瓶内套管中，加入5.0 mg • L-1内 标溶液1.0 mL，水3.0 mL，再用甲醇定容至

• 1288 •

裡识&睡-圯莩分冊____________________________李晶，等：超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁尼古丁和可替宁可达到基线分离，且分离时间短。

用蠕动泵以10

• mirT1流量连续注射，将

50.0 pg • L_1的尼古丁、可替宁、D4-尼古丁和D3-可 替宁混合标准溶液注人电喷雾离子源中，在正离子 模式下对目标物进行一级质谱扫描，得到相应的准 分子离子（[M+H]+)峰，然后对准分子离子峰进行 子离子扫描，得到离子碎片信息。尼古丁的定量离 子对w/z为163.1/117.2;D4-尼古丁的定量离子对 w/z为167.1/121.2;可替宁的定量离子对/n/z为 177.2/80.2;D3-可替宁的定量离子对m/z为180.2/ 83.2。

以目标物的响应信号和质谱峰为考察目标，进 一步对碰撞电压、去簇电压等参数进行考察。结果 表明：碰撞电压为28 V、去簇电压为30 V、驻留时间 为100 ms时，尼古丁和可替宁均具有较高的灵敏 度。试验选用碰撞电压为28 V、去簇电压为30 V、 驻留时间为100 ms。2.3样品前处理条件的选择

尿液样品含有多种蛋白质和酶，为了进行即时

的烟草暴露信息监测，必须对样品进行前处理。尿 液样品中尼古丁相对稳定，半衰期较长，但可替宁由 于半衰期较短，在尿液中活性酶的作用下会继续分 解.1 d内降解率就达30%，可采用硫酸氢钠作为稳 定剂[11]。采用LC-MS/MS测定时，加人硫酸氢钠 会造成基质效应，会使质谱检测器灵敏度大大下降， 并影响分析结果。

试验发现尿液样品中加入甲醇对可替宁具有很 好的稳定效果。试验分别考察了尿液样品中甲醇的 体积分数依次为10%，20% , 40%，60%，80%时对 尿液中可替宁稳定性的影响。结果表明：样品中甲 醇的体积分数在50%以上时，样品中的可替宁可保 持稳定，在1周内降解率不超过5%,可以进行样品 的分析。考虑到样品介质与流动相（含体积分数为 60%的甲醇）相匹配时，色谱峰的干扰较小，利于分 析。试验选择尿液样品中甲醇的体积分数约为

60%。

于试验的高通量开展.并保障了样品分析的平行性。

在LC-MS/MS分析中，基质效应的存在会显 著影响分析物的响应，降低测定结果的准确 性[1314]，尿液样品成分复杂，基质干扰较大。为了 避免基质干扰，试验选择同位素内标法，并采用实际 尿液样品为基质进行标准曲线的绘制。结果表明： 采用甲醇直接配制标准溶液（不加同位素内标）进行 样品分析，尿液样品平行测定7次，尼古丁和可替宁 的回收率在76.8%〜82.3%之间。采用同位素内标 法和实际尿液样品为基质绘制标准曲线后，尼古丁 和可替宁的回收率在93.6%〜112%之间。这说明 基质效应的影响得到了有效扣除。2.4标准曲线和检出限

LC-MS/MS具有特异性强和灵敏度高的优点， 但是基质效应干扰也是样品分析中常需要关注的问 题。尿液样品中存在的无机化合物（电解质和盐类） 和有机化合物（酚类、色素糖类、胺类、尿素、脂类、肽 类等）均会对分析结果产生影响。因此，试验中除采 用同位素内标外，还采用以实际样品为基质进行标 准曲线绘制的方法来避免由于样品基质效应造成分 析结果的不准确。

平行移取1.0 mL的尿液样品7份于样品内套 管中，分别加人5.0 mg • L-1内标溶液1.0 mL和水3.0 mL，然后再分别加入10.0 mg • L_1混合标准溶 液 0,0.02,0.05,0.10,0.50，1.0,2.0 mL,用甲醇定容 至10.0 mL(控制其中甲醇的体积分数约为60%)， 在外套管的口部卡上内套管充分摇匀，然后过滤、转 移，最后收集萃取溶液，利用选定的试验条件进行分 离和测定。将“基质标准溶液峰面积减去空白峰面 积，再除以内标峰面积”与对应的质量浓度进行回 归，并绘制标准曲线，尼古丁和可替宁的线性范围、 线性回归方程和相关系数见表1。

根据3倍信噪比计算方法的检出限（3S/N)，根 据10倍信噪比计算方法的测定下限（10S/N)，结果 见表1。

2.5精密度和回收试验

按试验方法对3个尿液样品进行分析，平行测 定7次，连续测定7 d,并进行加标回收试验，计算回 收率和测定值的日内相对标准偏差（RSD)和日间 RSD，结果见表2。

由表2可知：回收率在93.6%〜112%之间。方 法回收率较为理想，可以应用于实际样品的分析。

尿液样品成分复杂，基质干扰较大，文献[11- 12]报道尿液样品中尼古丁和可替宁的测定需经样 品萃取、离心分离、滤膜过滤等步骤。试验中通过对 样品前处理过程进行考察，设计了可批量稳定前处 理样品的装置，该装置可以集样品前处理、过滤和转 移于一体，大大节省了样品前处理的中间环节，有利

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理汜艏验-m莩分册表1

Tab. 1 化合物尼古丁可替宁

李晶，等：超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁

线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限

Linearity ranges, linear regression equations, correlation coefficients, detection limits and lower limits of determination

线性范围^/

线性回归方程3^ = 68.13x + 57.843； = 56.59 x-4.820

相关系数0.998 60.998 9

检出限<〇/

测定下限“

(/Ltg • L-1)

19.012.3

(fj.g • L_1)

20.0〜2 00020.0〜2 000

(.fxg • L-1)

5.73.7

表2

Tab. 2

精密度和回收试验结果（n=7)

Results of tests for precision and recovery (w = 7)

加标量400测定总量!〇/ (fxg • L-1)1 246.7837.5641.21 182.1712.0578.8

• L_1回收率/

加标量800测定总量\" (fxg • L-1)1 628.41 242.51 038.61 547.31 112.9989.2

* L_1回收率/

曰内RSD/

曰间RSD/

加标量200卩g • L_1

样品

化合物

测定值V

(fxg • L-1)

测定总量以

回收率/%93.610895.511295.0104

(fxg • L-1)

123123

可替宁尼古丁

814.8452.7231.2761.5322.8184.6

1 002.0668.7422.2985.3512.7393.6

%

10896.210210597.398.6

%

10298.710198.298.8101

%

3.03.43.12.93.23.3

%

3.23.33.63.23.43.5

由表2还可知：尼古丁的日内RSD在3.0%〜 3.4%之间，日间RSD在3.2%〜3.6%之间；可替宁 的日内RSD在2. 9%〜3. 3%之间，日间RSD在 3.2%〜3.5%之间。方法具有较好的重复性。2.6样品分析

按试验方法分析9名吸烟志愿者（每天抽吸量： 重度25〜50支、中度15〜25支、轻度5〜15支）的 尿液样品（含量如超过线性范围，稀释后再分析），同 时参考文献[7]方法（气相色谱法）对分析结果进行 比较，结果见表3。

表3

样品分析结果

jig • L

Tab. 3 Analytical results of the samples

测定值

样品

尼古丁

重度吸烟者1重度吸烟者2重度吸烟者3中度吸烟者1中度吸烟者2中度吸烟者3轻度吸烟者1轻度吸烟者2轻度吸烟者3

826569490459363258235117148

本法

可替宁48875932821849518812186.7212

气相色谱法尼古丁842576476470371249228118154

可替宁46677533321250219411882.3207

定值一致，测定结果可靠。

本工作立足研究卷烟烟气生物标记物，采用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的含量，方法测定结果准确可靠。本工作设计了可快速前处理的样品萃取瓶，大大简化了样品前处理过程，实现多批次稳定测定。今后会在批处理自动化以及多批次一体化处理方面进行继续改进，另外还将对样品前处理装置的筛板和密封效果进行改进。参考文献：

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由表3可知：本法的测定值和气相色谱法的测

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Rapid Determination of Nicotine and Cotinine in Urine

of Smokers by UHPLC-MS/MS

LI Jing1 , LIANG Mengjie2, LIU Xin1 , WANG Jin1 , HUANG Haitao1 , XU Yong1 ,

LI Xuemei1, YANG Guangyu1 , KONG Weisong1 , YANG Yekun1 #

(A. Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming 650106，China ;

2. School of Pharmacy, Kunming Medical University ^ Kunming 650504, China)

Abstract: The urine samples of smokers were prepared by a self-designed extraction vial. UHPLC-MS/MS

was applied to the rapid determination of nicotine and cotinine in the extract. Waters ACQUITY UPLC BEHHILIC chromatographic column (50 mmX2.1 mm，1.7 pm) was used as stationary phase，and methanol (6 + 4) solution [containing 0.1% (mass fraction) ammonia] was used as mobile phase； positive ionization was used in MS/MS. D4- nicotine and D3-cotinine were used as internal standards. Linearity ranges of nicotine and cotinine were found in the same range of 20.0 — 2 000 pg • L_1，with detection limits (3S/N) of 5.7,3.7 jig • L_1 ♦ respectively. Tests for recovery were made by standard addition method at the concentration levels of 2.0, 4.0* 8.0 fig. Values of recovery were in the range of 93.6% — 112%，and values of intra-day RSDs (w = 7) and inter-day RSDs (w = 7) of determined values were in the range of 2.9% —3.4% and 3.2%一3.6%, respectively.

Keywords： UHPLC-MS/MS; nicotine； cotinine； smoker； urine

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