蛋白激酶C调节的1,4,5-三磷酸肌醇受体磷酸化在胆囊收缩素介导的胃窦平滑肌细胞钙动员中的作用

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・６６４・　２００７年３月１３日第８７卷第１Ｏ期Ｎａｔ］Ｍｅｄ　Ｊ　Ｃｈｉｎａ，Ｍａｒｃｈ　１３，２００７，Ｖｏｌ　８７ｔ　Ｎｏ．１０　．胃肠动力与功能性疾病・　蛋白激酶Ｃ调节的１，４，５一三磷酸肌醇受体　磷酸化在胆囊收缩素介导的胃窦平滑肌　细胞钙动员中的作用　司新敏黄磊罗和生Ｓｈｅｌｌｅｙ　Ｃｈｉｒｅｙａｔｈ　Ｐａｕｌ　吕鹏　【摘要】　目的研究八肽胆囊收缩素（ＣＣＫ－８）对大鼠胃窦平滑肌细胞（ＳＭＣ）胞内钙释放和胞　外钙内流的作用及对其具体相关机制的探讨。方法（１）多导生理记录仪记录大鼠离体胃窦肌条在　不同条件下的收缩活动；（２）免疫印迹法和免疫沉淀法检测胃窦ＳＭＣ的三型１，４，５－三磷酸肌醇受体　（Ｉｎｓ　Ｐ３Ｉ１３）及其磷酸化水平；（３）Ｆｕｒａ一２／ＡＭ标记胃窦ＳＭＣ，观察ＣＣＫ－ＳＳ对胞内钙离子浓度（［ｃａ　］　ｉ）的影响；（４）全细胞膜片钳检测胃窦ＳＭＣ的Ｌ一型电压门控钙通道电流（Ｉ　。　）的变化情况。结果　（１）ＣＣＫ￣Ｓ作用下胃窦肌条收缩幅值和频率改变明显［增长率分别为（６２±１３）％和（５８±１７）％，均　Ｐ＜０．０１］，可被ＣＣＫ－Ａ受体拮抗剂和钙泵抑制剂所阻断；（２）蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）上调ＩｎｓＰ３Ｉ１３磷酸化　水平，抑制ＣＣＫ－ＳＳ介导的内钙释放；（３）ＣＣＫ￣Ｓ引起的［ｃａ“］ｉ显著升高［从（６９±７）ｍｏｌ／Ｌ升至　（４７２±３６）ｎｍｏｌ／Ｌ，Ｐ＜０．０１］分别可被ＣＣＫ・Ａ受体或胞内钙泵抑制剂和ＰＫＣ激动剂所阻断；去除外　钙或给予Ｌ－型钙通道阻滞剂时ＣＣＫ－ＳＳ仍可引起［Ｃａ２　］ｉ升高；（４）ＣＣＫ－ＳＳ显著增强胃窦ＳＭＣ的　Ｉ　［从（一５６±７）ｐＡ升至（一８９±６）ｐＡ，Ｐ＜０．０１］，可分别被ＩＣ．－Ｌ阻滞剂、胞内钙泵抑制剂和钙依赖　性氯通道阻滞剂所阻断。结论ＣＣＫ－ＳＳ引起的大鼠胃窦ＳＭＣ的［ｃａ　］ｉ升高依赖于ＰＫＣ介导的　ＩｎｓＰ，Ｒ３磷酸化作用调节下的细胞内钙离子释放。胞内钙释放可激活Ｉ。。，引起细胞膜去极化而活　化Ｉ　引起胞外钙内流，最终引起ＳＭＣ收缩效应。　【关键词】缩胆囊素；肌醇１，４，５－三磷酸；膜片钳术；　胃肌条　ｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｎａｓｅ　Ｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅⅢｉｎｏｓｉｔｏｉ　１，４，５－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｌｎｉｎ　ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃａｌｃｉＢｉｌｌ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｔｒａ］ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ＳＩ　Ｘｉｎ—ｍｉｎ　，ＨＵＡＮＧ　Ｌｅｉ，ＬＵＯ　Ｈｅ－ｓｈｅｎｇ，Ｓｈｅｌｌｅｙ　Ｃｈｉｒｅｙａｔｈ　Ｐ∞　。　Ｐｅ　．’Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｅｏｐｌｅ　ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｆｏ　“　ｎ　Ｕｍｖｅｎ　，　ｎ　４３００６０．Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｌ　一ｓｈｅｎｇ。Ｅｍａｉｌ：ｓｕｒｇｅｏｎｈｕａｎｇ＠１２　ｃｏｍ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｕｌｆａｔｅｄ　ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ　ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ（ｓＣＣＫ－ＳＳ）ｏｎ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎｆｌｕｘ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｔｒａｌ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ（ＳＭＣ）　ｎａｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｔｈｅｒｅｏｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１）Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ　ｍｕｓｃｌｅ（Ｉ朋）ａｎｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｍｕｓｃｌｅ（ＣＭ）ｓｔｒｉｐｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｔｒｕｍ　ａｎｄ　ｐｙｌｏｒｕｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　ｉｎ　ａ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｈａｍｂｅｒ　ｔｏ　ｒｅｃｏｒｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｂｙ　ｏｐｌｙｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈｙ．（２）Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｉｎｏｓｉｔｏｌ　１，４，５－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｉｎｓ　Ｒ　）ｉｎ　ｔｈｅ　ＳＭＣｓ．（３）Ｔｈｅ　ｒｅｓｏｐｎｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ＳＭＣ　ｔｏ　ＣＣＫ￣Ｓ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｆｕｒａ－２．１ｏａｄｅｄ　ｍｉｃｒｏｌｆｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｌｕａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（［Ｃａ２　］ｉ）．（４）Ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｏｆＬ．ｔｙｐｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ（ＩＣａＬ）ｗａｓ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　（１）Ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｔｏ　ＣＣＫ￣Ｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ａｍｐｌｉｔｕｄｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＭ　ａｎｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ＬＭ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｔｒｕｍ　ｎａｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ—Ａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＫ－ＡＲ）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ａｎｄ　ＡＴＰ雎ｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．　（２）ＣＣＫ￣Ｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＭＣ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ＰＫＣ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩｎｓＰ３　Ｒ１．（３）ＣＣＫ－８Ｓ－ｅｖｏｋｅｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｉｎｃｒｅｓａｅ　ｉｎ［ｃ　］ｉ［ｆｒｏｍ（６９±７）ｍｏｌ／Ｌ　ｔｏ（４７２±３６）ｎｍｏｌ／Ｌ，Ｐ＜０．Ｏ１］ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ－ＡＲ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ＡＴＰａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ（ＰＫＣ）ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ｗｈｅｒｅａｓ　ｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｔｈａｔ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｗａｓ　ｒｅｍｏｖｅｄ　ｏｒ　Ｌ．ｔｙｐｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｎｉｆｉ￣ｐｉｎｅ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｂｕｔ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ［ｃ　］ｉ　ｃｏｌｕｄ　ｂｅ　ｓｉｔｌｌ　ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ．８ｓ．（４）ＣＣＫ－８Ｓ．ｉｎｔｅｎｓｉｉｆｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ　［ｆｒｏｍ（一５６±７）ｐＡ　ｔｏ（一８９±６）ｐＡ，Ｐ＜０．０１］ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ　ｉｈｎｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　作者单位：４３０ｏ６０武汉大学人民医院消化内科（司新敏、罗和生、Ｓｈｅｌｌｅｙ　Ｃｈｉｒｅｙａｔｈ　Ｐａｕｌ、吕鹏）；华中科技大学同　济医学院同济医院小儿外科（黄磊）　通讯作者：罗和生，Ｅｍａｉｌ：ｓｕｒｇｅｏｎｈｕａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年３月１３日第８７卷第１０　Ｎａｔｌ　Ｍｅｄ　Ｊ　Ｃｈｉｎａ，Ｍａｒｃｈ　１３，２０ｉＹ７，Ｖｏｌ　８７，Ｎｏ．１０　ｏｆ　ｎｉｉｆｄｉｐｉｎｅ．ＡＴＰａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ａｎｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌ（Ｉｃｌ－Ｃ．）ｂｌｏｃｋｅｒ（ａｌｌ　Ｐ＜０．０１）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＣＣＫ－８Ｓ－ｅｖｏｋｅｄ［ｃａ　］ｉ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｔｒｌａ　ＳＭＣｓ　ｄｅｐｅｎｄｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｉｎｔＩ　ａｃｅⅡｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｔｏｒｅｓ。ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＰＫＣ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩｎｓＰ３　Ｒ３．Ｔｈｅ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｉｎｔＩ　ａｃｅⅡｕｌａｒ　ｃａｌｃｉ哪ｉｎ　ｔｕｒｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｌ—ｔｙｐｅ　ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ（ＶＤＣＣ）ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌｓ，ａｎｄ　ｕｌｔｉｍａｔｅｌｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ　ｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｓｍｏｏｔｒｈ　ｍｕｓｃｌｅｓ．　ＩＫｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｃｈｏｌｅｃｙｓｏｔｋｉｎｉｎ；Ｉｎｏｓｉｔｏｌ　１，４，５－ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｐａｔｃｈ—ｃｌａｍｐ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｇａｓｔｉｒｃ　ｓｔｒｉｐｓ　胆囊收缩素（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ，ＣＣＫ）是一种广泛　钟收缩波次数计为收缩频率。　分布于胃肠道及中枢神经系统中，具有神经递质和　胃肠激素双重作用的脑肠肽…，其中硫化胆囊收缩　素（ｓＣＣＫ一８Ｓ）是最主要生物活性肽之一　。研究显　示ＣＣＫ通过激活磷脂酶Ｃ－Ｂ（ＰＬＣ－Ｂ）直接水解细胞　膜上的４，５－二磷脂酰肌醇（ＰＩＰ２），产生二酰基甘油　（ＤＡＧ）和三磷酸肌醇（ＩｎｓＰ　）　。其中ＩｎｓＰ　与内　质网上１，４，５－三磷酸肌醇受体（ＩｎｓＰ　Ｒ）结合，刺激　胞内钙释放引起［ｃａ　］ｉ升高引发细胞收缩、神经　传递等生理性反应，而ＤＡＧ则可激活蛋白激酶Ｃ　（ＰＫＣ）等激酶调节胞内钙动员　Ｊ。ＰＫＣ通过介导　ＩｎｓＰ　Ｒ３磷酸化而降低其对ＩｎｓＰ　的敏感性，是调节　胞内钙信号和多种细胞功能的一种重要的丝氨酸．　苏氨酸激酶　。本研究探讨了ＰＫＣ调节的ＣＣＫ介　导的胞内钙信号途径及ＩｎｓＰｓ．敏感的内钙释放和通　过Ｌ．型钙通道的外钙内流在钙动员时的作用。　材料与方法　１．离体肌条和单个平滑肌细胞（ＳＭＣ）制备：　健康成年清洁级ＳＤ大鼠（购于武汉大学动物实验　中心），体重２５０～３００　ｇ，猛击大鼠头部致昏，断颈放　血，迅速取胃，沿胃大弯剪开并在无钙的生理盐水中　漂洗干净后去除胃窦部黏膜。沿肌纤维方向分别切　取宽３　ｔｕｎａ，长８　ｍｍ的胃窦和幽门纵行及环形肌　条。制备单个ＳＭＣ时　Ｊ，将环形肌条剪成２　ｍｍ×　４　ｍｍ小块置于消化酶中，３６．０～３６．５　ｏＣ下轻微振　荡孵育２５～３０　ｍｉｎ，无钙的生理盐水洗５次，吹打组　织块，产生细胞悬液。所有肌条和细胞备用时均保　存于２～８　ｏＣ的ＫＢ液中。　２．离体肌条实验：固定肌条于垂直灌流槽中，　台氏液（３　ｍｌ／ｍｉｎ）持续灌流肌条，（３７　４－０．５）ｏＣ下　持续充以Ｏ　（９５％）和ＣＯ　（５％）的混合气体。将肌　条处于自然长度（不过度牵拉或松弛），孵育６０　ｍｉｎ，　当稳定的自发性收缩出现后记录给药前后肌条收缩　活动幅值和频率的变化。以给药前作为对照值，给　药后作为效应值，用变化百分数来表示［变化百分　数：（效应值一对照值）／对照值×１００％］。每分　３．免疫沉淀、凝胶电泳和免疫印迹：取１　ｍｌ经　过处理的ＳＭＣ悬液加入５００　ｌ裂解液，冰上放置　４０　ｍｉｎ后，４℃下１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，取上清　测定蛋白总量。加入特异性的ＩｎｓＰｓＲ３单克隆抗体　（１：１００）４℃下孵育２　ｈ后，再加入蛋白珠Ａ，４℃轻　微摇动１　ｈ，４　ｏＣ下２０００　ｒ／ｍｉｎ离心１　ｍｉｎ弃上清。　对照组样本不加抗体进行相同处理。缓冲液洗涤沉　淀５次后加入上样缓冲液，１００　ｏＣ变性５　ｍｉｎ。上清　经１２％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳法　（ＳＤＳ・ＰＡＧＥ）分离后转移到预先用磷酸化丝／苏氨　酸底物抗体（１：１０００）孵育过的硝酸纤维素膜上，以　特异性检测包含在ＰＫＣ酶解底物序列中的磷酸化　的丝／苏氨酸残基。免疫沉淀经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分　离后，电转移至硝酸纤维素膜，与ＩｎｓＰ　Ｒ３单克隆抗　体（１：１０００）４℃下孵育过夜，检测ＩｎｓＰ　Ｒ３总量。　显色后置于ｘ线胶片上曝光后显影。　４．Ｆｕｒａ－２／ＡＭ负载细胞：细胞悬液中加入钙荧　光探针（Ｆｕｒａ）－２／ＡＭ（终浓度为１０￣ｍｏｌ／Ｌ），３７　ｏＣ　温育３０　ｍｉｎ后无钙的生理盐水液洗２次，调细胞悬　液为５×１０　／Ｌ。激发光波长为３３４　ｎｍｏｌ／Ｌ及３８０　ｎｍｏｌ／Ｌ，发射光波长为５４０　ｎｍｏｌ／Ｌ，采样间隙为３　ｍｓ，记录单个平滑肌细胞在给药前后的荧光强度变　化，得到Ｆ　／Ｆ，　。的比值，由以下公式　计算出　［Ｃａ　］ｉ。［Ｃａ　］ｉ＝Ｋｄ［（Ｒ．Ｒｂ）／（Ｒ　ｉ－Ｒ）］ｂ，其　中Ｋｄ为Ｆｕｒａ－２／ＡＭ与ｃａ　反应的解离常数（２２４　ｎｍｏｌ／Ｌ）；Ｒ＝Ｆ３３４／Ｆ３８０；ＲＨｉ为饱和钙荧光值（１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１　）；Ｒ　。为零水平钙荧光值（１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＧＴＡ）；ｂ＝Ｆ３８０ＲＨｉ／Ｆ３８０Ｒｂ。　５．细胞膜片钳实验：选取边缘齐整、横纹清晰　的ＳＭＣ于室温（２３～２５ｏＣ）下进行实验。取ＳＭＣ悬　液１　ｍｌ加入细胞池中并平放于倒置显微镜上（１　Ｘ７０　型，ＯＬＹＭＰＵＳ），贴壁５　ｍｉｎ后台氏液灌流　（１　ｍｌ／ｍｉｎ）。拉制电极使其阻抗为３～４　Ｍｆｔ，进行高　阻封接后负压穿孔形成全细胞模式。细胞膜片钳实　验分两组进行：一组为对照组，用生理盐水灌流；另　一组为实验组，将药物加入生理盐水中灌流。在全　维普资讯 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２∞７　３司Ｉ　３日第８　茔第】０崩Ｎａｔ］Ｍ　ｉ　Ｊ　Ｃｈｉｎ　．２　ｌ７．￣　７Ｊ—　绿Ｉ｝抱模式Ｆ．』＝｝Ｊ　ＥＰＣ—１０・ＦＩＥＡＫＡ膜片铺敢人器记录　凄肌条静息张　』．环肌收缩力增　（７２±７）［１ｌｇ、增ｃ乏　ＩＩ＝¨ｌｌＩ运行Ｉ’（：Ｊ　Ｍｌ’软件（Ｙｅｔ－．－ｉｏｌｔ　６　０．２｝ＩＥＫＡ　Ｉｎｓｔｒｕｍ　ｒｌＬｓ）用于收集资料，井ｆｔｌ　Ｃｌａｍｐｆｉ［８　０程序　分析数据　６．溶液　ｊ试剂：消化液：０．１％Ⅱ型胶原酶、　率为（６２　４－ｌ　３）％，纵行肌条收缩频率增　（９．５±　２．３）；￣Ｉｔ＇ｎｉｒｔ、增ｆ＝乏率为【５８±ｌ７）％（图１Ａ～ｌＤ）．　．钙泵抑制剂毒胡萝Ｉ、素（ＴＧ，１０。、ｍｏｌｌＬ）和钙鳌台　剂ＢＡＦ＇ＦＡ—ＡＭ（ＢＡ．１０～ｍｄ／ｔ）可完全抑制ＣＣＫ一　０．０５％　硫另：帻醇、０．０５ｑ＋－胰蛋由晦抑制剂和１）２％　８ｓ对胃蜜肌条的作用［（一ＩＯ０±０）％．图Ｉｃ］；给予　ＣＣＫ—Ａ受体　ｉ断剂右氯谷胺（５×１０　ｍｏＬ／Ｌ）或Ｌ－　型钙通道阻滞剂硝苯地、Ｆ（１０、ｎｌｏ１／Ｉ　）可抑制　ｃ（：Ｋ．８ｓ增强效应【Ｉ訇１Ａ，ＩＢ，ｌＤ），而ＣＣＫ・Ｂ受体　阻断剂Ｌ－３６５．２６０（５×】０　ｍｏｌ／１　）则无明显影响　ｆｎ【清白蛋口溶人无钙的生理盐水；见钙的生理盐　水（ｍｍｏｌ／Ｉ　）：氯化钠ｌ　３４．８、氯化钾４　５、羟乙基哌　唪乙磺酸１０、氯化镁Ｉ　葡萄糖ｌ０，　Ｉ　７．４；生理盐　水（ｎ￣ｎｏｌ／Ｌ）：尤钙的　理盐水加入２　ｎｕｎｏｌ／Ｌ氯化　钙；台氏液（ｍｍｏｉ／１，）：氯化钠１４７、氯化钾４、氯化钙　２、磷酸二氢钠０．４２　磷酸氢二钠２　氯化镁１．（）５、葡　萄棒５　５．以氢氧化钠凋　ｐｌｉ７　４；Ｋｒａｆｌ　Ｂｒａｈｅ液　（ＫＢ液．ｍｍｏ［／Ｉ　）：乙　醇阴乙酸酯０．５、羟乙基哌　嗪乙磺酸１０、氯化镁３、氯化钾５０、箭萄瓣ｌＯ、Ｉ　一谷　。　Ｈ　¨　｝Ｉｆ　＊　＠　氨酸５（）、牛磺酸２０、磷酸　氧钾２０．埘ｐＨ至７．４；　Ｌ一　钙通道电极内记录液（ｍｉｎｏｒ／Ｉ　）：氯化铯１　３５、氯　化镁４、羟乙基哌嗪乙磺酸１０、Ｎａ。一ＡＴＰ　２、乙　醇【刖　乙酸酯】０、四乙铵２Ｏ，用Ｔｒｉｓ稠ｐＨ　７．３５；缓冲液　４　ｔ蛳ｌ眦　ｃｃＫ－ｇ　ｓ　姊拟２　…一———　西　”ｗＩ．Ｉ　　图１　胃塞肌笨的变化ｋｌ￣＇　—　；　＠　…　；　＠　ｉ＾惯窭纵彤　条先后蛤　ＣＣＫ一　（ｍｍｏｌ／Ｌ）：氯化钠１５０、氟化钠１００、　ｓ　５０、乙二胺　四乙酸ｌ０、Ｉ％聚乙二醇辛基苯基醚、无ＥＤＴＡ的蛋　白酶抑制剂１．　为７．４一ＣＣＫ－８Ｓ　二硫苏精醇、胰　蛋白酶抑制剂、牛［０【清自蛋白、羟乙基哌嗪乙磺酸、　８ｓ和　瓠薛畦：Ｉ　Ｂ胃窦环形肌条先后给予ＣＣＫ￣Ｓ和　氟　粹ｃ艋；１Ｃ胃窭群蟛肌条先　精　ＣＣＫ４￣Ｓ和毒胡　ｈ隶盐　ＨＡＶＦＡ一＾Ｍ；ＩＤ胃安环形肌条先目龄了ｃ：ｃＫ－８Ｓ和硝举地　：ＴＧ：蓐捌萝ｈ翥；ＢＡ：ＢＡＩｒＩ＇Ａ—ＡＭ　乙二醇四乙酸酯、氯化铯、四乙铵、硝笨地　、Ｌ一３６５，　２６０、Ｆｕｒａ－２／ＡＭ、毒胡萝　素、ＢＡＰ１’Ａ　ＡＭ、白　菜红　碱，、尼氟　酸、佛波醇酯等药　均９１｛：】于美国Ｓｉｇｍａ　公玎］：１Ｉ　胶原酶购Ｉ　美国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｉｌ￣ｉ．ｃｈｅｍｉｃａｌ　２．ＣＣＫ一８Ｓ促进ＰＫＣ依赖的ＩｎｓＰ，Ｒ３磷酸化：　样本预先缩　乖ｕ不给予ＰＫＣ特异性抑制剂１３腼菜　红碱（５×１０一ｍｍｏｌ／Ｌ）后ｍＪ人ＣＣＫ－８Ｓ（５　ｘ　ｌ０　ｍｍｏｂ／［　）；ＰＫＣ激动剂佛渡醇酯（１Ｏ　ｍｍｏＬ／Ｉ　）　公司：Ⅲ　ｌｎｓｔ　Ｉ＇１一单克隆抗体．蛋白珠Ａ购于美国　Ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；磷化毒士氡酸／苏氨酸底物　抗体购ｆ美国Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉ，ｌｇ公司；过氧化物酶结台　的次级抗体购　：美国Ｒｉｏ—Ｒａｄ公川：右氯谷胺由意　大利Ｒｏｔｔａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ实验室惠赠　７．统汁学方法：统计学分析采用　对　榆验，　处理的样本作为阳性对照。所有样本均反应５　ｍｉｎ　．　免疫沉淀ＩｎｓＰ　Ｒ３，凝胶电泳后转膜　硝酸纤维蟆上　顶先封闭的特异性抗体能识别磷酸化底物中一２或　３位点Ｌ的磷酸化的丝／．｛ｊ、氨酸残基　ＣＣＫ．８Ｓ怍　的磷酸化水平商ｆ正　在　实验结果以ｘ±　丧永　Ｈ儿祭实验结粜进行归一化　处理，即除以Ｘ，Ｎ！￣＿ｅｌｌ巾敲凡值所得的￥　ｔ值，然后用　（　±ｓ）％表示膜片钳吏验采用膜　钳数据软件　Ｃｌａｍｐｆｉｌ　８　０　『统计软件ＳＰＳＳ　ｌ３　０进行配对，检　验，并在ＧｒａｐｈＰａｄ　１　Ｔｌｓｔａｌｅ　３　０制　结　果　用的样奉ｔｌＩ（罔２Ａ），ｌｎｓｔ’　刮阻断ＣＣＫ．８Ｓ增　磷酸化的发斗．。　常对照绢细胞　刳２Ｈ），向州菜红碱抑制ＰＫＣ活降　ｌｎｓｔ，　Ｒ３磷酸化的效廊ＰＫＣ　性对照组『ｆ１．给　佛波阵酯¨　介导ｌｎｓＰ　Ｒ３　３．荧光实验结果：静息状态卜胃宴ＳＩＭＣ内游　离钙浓虞［ｃａ　’ｉ为（６９±７）ｉｌｔｔ］ｏ［／［．（刚【条数：　３０），　以往结果牛Ｈ一致　。给　ＣＣＫ一８Ｓ（５×１０。　ｏｔｏｌ一／Ｌ）后．　ｃａ　ｉ挂苫升高　（６９±７）ｍｍ，ｌ／１　到　Ｉ　ＣＣＫ一８Ｓ对胃窦半滑肌条的收缩效廊：与给　药前　收缩　Ｊ为（４４±９）ｍｇ，频率为（４．２±１．９）次／　ａｒｉｎ　相比，ＣＣＫ一８Ｓ（５×１０～ｍｏｌ，　ｌ　）显著增强　宴　环形肌条收缩波平均振幅和纵行｝【『Ｌ条收缩频率及胃　（４７２±３６）ｎｍｏＬ／Ｌ　为研究ＣＣＫ－８Ｓ介导的钙动员　的钙来源．ＳＭＣ先后置于无钙和有钙液中，发现在　维普资讯 http://www.cqvip.com 中　隈学杂　２［ＸＩ７年３　Ｉ　３　Ｆｌ第８７携讹１０蹦Ｎａｔｌ＇ｖｌｅｄ　Ｊ　Ｃ［ｄ＇ｎａ，Ｍａ肿ｈ　１３　２０１￣７　ｖ．Ｉ　８７．　０　１０　２Ａ探制　瞬『眭化一夔／苏氪醯残基ＰＫＣ　ｉ：［…　蛳霭　』菌董壬　ｉ　２Ｂ探针：ｌｍＩ￣，Ｒ３　震孽　擎　，　童　萋　０　啦　Ｃ佛蛙醇障　ＣＫ　８Ｓ＠　．．～　一　。。　一０　ｒ１周茉红碱　佛城静疃ｉ　圈２　ＣＣＫ一８ｓ　激昕致盼ＰＫＣ依帻枘Ｊｎｓｌ￣３Ｒ３的磷醣化　ＥＣＫ￣Ｓ　２Ａ免疰机挂－ｒＪ　ＰＫＣ磷酸化赢物一２或　喧点卜　磷酸他的避／弗氪酸残麟与特异　抗体结合．免疫　涟法　幢制ＩｎｓＰ　Ｒ３　淀中磷酸化水下；２ｌ｛兜缦印迹法掩洲２＾　中ＩｎｓＰ、Ｒ３　淀水　ｊ　量　自　｝　…　佛被醇酵一八　＜二＝　八ｂ　｝ＣＣＫＫ８Ｓ＠　ｑ攀　无钙液中ＣＣＫ・８ＳＹｌ‘高［ｃａ。］ｊ低Ｊ’有钙液中【ＩＮ－　３Ａ）；另’方而硝苯地半不能完全抑制ｃｃＫ一８Ｓ引起　图４佛扳醇衙怍卅　的【ｃ　浓　恢帻巨柿制ＣＩ２Ｋ￣ｔＳ舟　ｆ由　Ｍｃ　．・升商Ｆｕｍ－２怀　旧　Ｍ【：颤梵蛤　小吼浓艟鸽　被　的［ｃａ　ｉ升高（图３Ｂ），即ＣＣＫ．８Ｓ引起的大鼠　窦ＳＭＣ胞内钙释放不依赖ｊ：外钙内流的刺激，ｆｕ内　流的钙可促进［ｃａ　］ｉ升高。在图４　ｒｆ１，预先给予　不同浓度的佛波醇酯（１×１０　ｍｏｌ／Ｌ、１×１０　ｍ。１／　—　，１ｏ口　Ｉｌ＂　ｕ～　搏喃４　ｍｉｎ后　缩　ｃ【Ｋ｛ｓ　４Ａ　Ｉ　ｘ１０　Ⅲ０ｌ／Ｉ：．ＩＢ　１　ｘ１０。。　ｏｔｏｌ／［　：４Ｉ：　ｌ　ｘ　１０　Ｔｔ１　Ｌ：－４Ｄ．Ｉ　ｘ　Ｉ（１～ｍ一，１　Ｉ　与Ⅱ　常对照相比，ＣＣＫ￣ＳＳ（５×１０『ｎＩ　１／［　）显　升至（一８９±６）　，肌　著增人Ｉ㈧［从（一５７±７）　Ｌ、１　ｘ　１０　’ｍｏＬ／Ｌ、ｌ×１０。、ｍ．ＩＺＬ）町呈浓度依赖陆　抑制ＣＣＫ－８Ｓ升高［ｃａ　］ｉ的效应，当给　１０～【ｎＩ，】／　条数＝１０．Ｐ＜０．０１］可漱５×１０～ｍｏｌ／１．纳右氯谷　胺显著抑制（肌条数＝７．Ｐ＜０．Ｏｌ，阁５Ｂ）　使用毒　胡萝卜素（１０。。、ｔｏｏｌ／Ｌ）嗣ｌ　ＢＡ　Ｉ＿Ａ．ＡＮ（１０一『ＴＩＤ【／Ｌ）　占除细胞内钙后明　抑制Ｊ　幅俄约为（９０±５）％　（肌条数＝１０．Ｐ＜１３．０１，图６）　含钙的台式液灌流　Ｌ佛渡醇酯儿乎达到完全抑制（『驾４）．这说明活化　ＰＫＣ可抑制，１０日Ⅱ）［Ｌ　：ａ　］ｉ～　　Ｊｔ‘高。实验结束后加八　［１＼一ａ廿１『日ｕ　５５　ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，　果：ｃａ“活－性良好　显著升高表示细胞　给于钙依帧性氯通道（１　）阻滞剂尼氟灭酸５×１０　ｍｏｌ／Ｌ后Ｉ　被抑制约为（８３±４）％（肌条数＝８．Ｐ　＜０．０１．图７）　图３　ＣＣＫ－８ｓ反复制激０Ｉ起的　Ｍｔ：【Ｃａ　’－ｉ空他　３Ａ．ｓＭｃ先后　ｒ无钙和存钙油　ｌ｜．３Ｒ．ｓＭ　ｃ　先置ｔ－冉　钙拙ｔ　．而后绗　硝带地－　４．膜片钳实验结果：采用电压阶跃刺激模式记　录日，钳制电压为一４０ⅡＩｖ．以ｌ０　ｔｎｖ的阶跃从　一４０・ｎＶＪＦ始去极化至４０　ｍＶ．维持４００　Ｉｌ１ｓ，刺激时　隔】０　Ｉｌｌｓ　内向电流峰值往刺激后５～１３　ｆｌ１．￣时出　现．Ｉ～Ｖ曲线中１０　ｎ・Ｖ时Ｌ．型钙通道电流（Ｉ　。）　最大，硝苯地平（１０。ｍｏｌ／Ｌ）可抑制电压为１０　ｍｖ　围５　ＣＣＫ￣Ｓ　矾举地’ｒ桐１卉瓤荇胺　胃安ｓＭｃ　Ｉ　Ｊ　的影晌５　与【ｌ　常对朋相比，硝堆地甲Ｉ叮　苒：抑制　ｌ　－；５Ｂ．彳　氯谷胺可显著抑制ＣＣＫ４￣Ｓ增强Ｉ“竹娥啦　的ｌ　约８０％（肌条数＝３，图５Ａ），证明该电流是　维普资讯 http://www.cqvip.com －　堡医堂壁点　！　三　ｉ　８７卷第ｉＯ蜘　＾　』Ｉ：ｌ　，　　旦　・己．　７』　讨　论　本实验证实ＣＣＫ－ＳＳ　Ｈ　显著增强大鼠胃安平滑　肌条和细胞的收缩，钙泵抑制剂毒胡萝Ｉ－素或１　一型　钙通道抑制剂硝苯地平均可阻断ＣＣＫ－８Ｓ的作用，　说明胞内钙释放和胞外钙内流引起的胞内钙升高是　ＣＣＫ－８Ｓ发挥作用的生理学基础　钙动员激动剂如　激素等引起的『ｃａ。］ｉ升高｝要包括阿个过程：内　钙释放引起的棚始钙峰值和外钙内流导致的平台　期　．．激素通过激活磷脂蹴肌醇特异。　磷脂酶Ｃ　（ＰＬＣ），水解磷脂酰肌醇（　Ｉ　）产生】ｌｉｓｐ　和ＤＡＧ　＠　ｌｎｓＰ　ｌ丌』瞬时分散到细胞内与内质　ｌ　的Ｉｎｓ　Ｐ｜Ｒ结　合，引起内质同内钙释放　ｆ　ｚｔ－ｃａ　ｉ瞬问ｎ　高”　，该过程决定着细胞多科，生物学效应．如钙依　赖性酶和通道的激衙，种经内分泌或细胞收缩　等…　激动剂等引发的细胞钙动员　很大稍　度上依赖　图６　点棘施；　钙可盟苦抑翻（：（Ｋ｛ｓ增强　ｊ于内质网钙释放动　Ｊ学饥制，并受多种因素的影响，　其巾蛋自激酶如ＰＫＣ等介导的ｌｎｓＰ，Ｒ磷酸化起重　的墩脯。４　常刊Ｊｌ《《（６＾¨柑比，ＣＣＫ－ＳＳ口』　并增强Ｌ　Ｌ　６Ｂ）．使片Ｊ毒　求却　要的嗣节作ｊＩｊ【Ｉ：　研究发现ＰＫＣ有多种生物学亚　，ＢＡＩ　ｌ　Ａ・ＡＭ击除胞　钙后划ｉ点娥臆诎硅著抑制　【６Ｃ　其中以ｄ、日、　、ｓ、　、∈、　、‘冉ｌ　８种钙依赖、ｌｔ删　为主分布于胃肠道ＳＭＣ』　’　生理条件Ｆ，ＰＫＣ　被ＤＡＧ、Ｃａ　或磷脂激活　以调节包括基因转导，　细胞增殖和细胞收缩等多种信号通路的传导　。　本实验证实ｆ－ＰＫＣ在ＣＣＫ－ＳＳ介导的夫鼠胃窦ＳＭＣ　钙信号巾的捌节作用　活化的ＰＫＣ通过介导　ｌｎｓＰ，Ｒ磷酸化．抑制ＣＣＫ一８Ｓ　）ｌ起的ＩｎｓＰ　敏感的钙　库钙动员一在率实验中，使用水同浓度的ＰＫＣ激动　剂后叫Ｊ坠浓度依赖性抑制ＣＣＫ—ｇＳ介导的大鼠胃窦　ＳＭＣ的ｌｎｓＰ￣敏感的钙库钙离　动员．　ＰＫＣ通过磷　酸化ｌ　Ｐ　Ｒ中不同位点上的缝／　：氨酸，磷酸化后　的ＬｎｓＰ　Ｒ显著降低ｒ划ｌｎｓＰ　的敏感性，从而抑制　ＩｎｓＰ　敏感的内质网钙库钙释放　０　ＰＫＣ通过磷　酸化ｌｎｓｌ’　Ｉ　抑制内钙释放的效应，对防ｌＩ：激动剂引　起的内钙过度释放而导致钙库枯竭　进而引发的损　伤组Ｊ胞有　关重要的作¨　ＰＫＣ这种保护性负反　馈机制　方而源于内钙过Ｊ叟释放引起的Ｉ＝Ｊ＿Ｉ质网自身　应急信号的激活．＂　方面可防ｌ卜　钙过窿释放导　致能量浪费引起的细胞损伤效应的发生　”】细胞质巾（：ｄ　‘浓度是胃肠平滑肌活动的决定　图７钙侬嘞性氯堪道【ＪＣＩ　ｃｎ）　【断剂　瓤　酿ｎ；娃簧抑创ｃｃＫ粤ｓ增强ｌ【　曲艘啦　ｊ１ｌ　常　对照（７＾）相比．ＣＧＫ－８Ｓ，叮　并　碰Ｉ　【７Ｂ　．尼氟火Ｉ拔呵显著抑制缓敢沲（７ｃ）　性因素　研究显　．细胞内钙贮库排钙和胞外钙　水平，泼作用可教右　山涟是网个紧密联系互为因果的关系　在本芟验　中，ＣＣＫ－ＳＳ　著增强胞内（　氯谷胺阻断．这充分蜕明ＣＣＫ－－ＳＳ与胃窦幽门ＳＭＣ　维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年３月ｌ３日第８７卷第ｌＯ期Ｎａｉｌ　Ｍｅｄ　Ｊ　Ｃｈｉｎａ，Ｍａｒｃｈ　！　．　表面上的ＣＣＫ—Ａ受体结合导致胞内钙离子浓度升　高是ＣＣＫ．８Ｓ增强肌条收缩活动的基础。在使用选　择性肌质一内质网钙一三磷酸腺苷激酶抑制剂和钙离　子螯合剂耗尽胞内Ｃａ２　后发现，一方面ＣＣＫ一８Ｓ增　强肌条的收缩效应明显被抑制，另一方面被ＣＣＫ一８Ｓ　升高的胞内ｃａ２　水平也显著减小，这可能说明钙库　释放的钙是升高胞内钙水平引起肌条收缩的重要因　素。同时在阻断胞外钙进入细胞内的情况下给予　ＣＣＫ一８Ｓ，细胞内钙浓度仍然可以显著升高但低于阻　断前的水平，这说明胞内钙泵释放钙不依赖于胞外　钙的进入。以往研究表明，Ｌ—Ｃａ通道存在于胃肠道　平滑肌细胞膜上，其激活依赖于受体激动剂导致的　平滑肌细胞膜去极化的发生¨引。本实验中Ｌ．型钙　通道阻滞剂显著抑制ＣＣＫ一８Ｓ对平滑肌条的增强效　应，说明细胞膜外钙离子通过Ｌ—ｃａ通道进入细胞　内，其在ＣＣＫ一８Ｓ作用下胃窦幽门平滑肌细胞去极　化产生动作电位的过程中起着重要作用。然而在使　用毒胡萝卜素和ＢＡＰＴＡ—ＡＭ耗尽胞内ｃａ　后发现，　ＣＣＫ－８Ｓ对Ｉ　札的增强效应消失；此外，给予钙激活　性氯通道（Ｉ　。）阻滞剂尼氟灭酸阻断ＳＭＣ胞膜上　的Ｉ　．ｃ。，最初ＣＣＫ一８Ｓ增强Ｉ　札的效应被显著抑制。　由此推断，钙贮库排钙是激活胃窦平滑肌细胞Ｌ．　Ｃａ　通道的前提条件，释放出的Ｃａ　引起胞内Ｃａ２　升高可能激活钙激活性氯通道，引起细胞膜去极化　并导致Ｌ—Ｃａ　通道开放进一步增强膜去极化，最终　引起细胞收缩活动的发生，这与Ｈａｄｄｏｃｋ等¨　研究　结果一致。　综上所述，ＣＣＫ一８Ｓ增强大鼠胃窦平滑肌收缩是　内钙释放和外钙内流共同作用引起的ＳＭＣ胞内钙　升高的结果，内钙释放可激活ＳＭＣ膜上钙激活性氯　通道引起的膜去极化是外钙内流的基础。其中　ＰＫＣ介导的ＩｎｓＰ，Ｒ３的磷酸化可呈浓度依赖性抑制　ＣＣＫ－８Ｓ介导的胞内钙释放，从而防止内钙过度释放　引起的细胞损伤效应的发生。　参考文献　Ｄａｖｉｄ　ＷＡ，Ｍｕｌｕｇｅｔａ　Ｍ，Ｋｏｋｉ　Ｋ．ｅｔ　ａ１．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ａｎｄ　ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｅｖｏｋｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ＣＣＫ＿８　ａｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｂｙ　ｌｕｎ＇ｓｎｏｎｏｍｉｃｒｏｍｅｔｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ．　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇａｓｔｏｒｉｎｔｅｓｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２Ｏ０４。２８６：Ｇ３２１．Ｇ３３２．　［２］　Ｊｎａ　Ｗ，Ｂａｎａｆｓｃｈｅ　Ｍ，Ｃｏｍｅｌｉｓ　ＢＬ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＣＣＫ　ｏｎ　ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｍｏｔｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ．　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９８。２７４：Ｇ９３９．Ｇ９４４．　［３］Ｓｔｅｐｈｅｎ　ＶＳ，Ｄａｖｉｄ　ＲＧ，Ｊａｓｏｎ　ＩＥ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｌ，４，５－ｔｆｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｇｎｎｉｓｔｓ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ａｃｉｎａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３１９４９－３１９５６．　［４］周吕，神经胃肠病学与胃肠动力研究的进展／／周吕，柯美云．　神经胃肠病学与动力（基础与临床）．北京：科学出版社，　２０ｏ５：ｌＯ—ｌ１．　［５　ｌ　Ｍａｉ　Ｍ．Ｔｒｉｖｅｄｉ　Ｓ，Ｌａｎｅ　ＣＲ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ａｔ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　８８８　ｉｎ　Ｃａ２　一ｓｅｎｓｉｎｇ　ｅｒｃｅｐｔｏｒ（ＣａＲ）ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｔｏ　Ｃａ２　ｓｔｏｒｅ　ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，ｌ９９８，２７３：２ｌ２６７－２ｌ２７５．　［６］Ｉｎ　ＤＫ，Ｓａｎｇ　ＤＫ，Ｋｅｎｔｏｎ　Ｍ．Ｐｕｒｉｎｅｒｓｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｏｕｔｗａｒｄ　ｃｕｒｒｅｎｔｓ　ｉｎ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｔａｃｎｉａ　ｃｏｌｏｎｉｃ　ｍｙａｃｙｔｅｓ．　Ａｍ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏ１．２０００．２７８：３５２－３６２．　［７］Ｉｊ　Ｂ，ｗｕ　Ｑ，Ｓｈｉ　ＪＳ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｉｎｅ　ｏｎ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｌｕａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＰＫＣ　ａｃｔｉｉｖｔｙ　ｏｆ　ｒａｔ　ａ０ｎａ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕ８４￣ｌｅ．Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ．２００５．５７：２４０．２４６．　［８］Ｋａｒｎａｍ　ＳＭ，Ｇａｂｒｉｅｌ　Ｍ．ｃＧＭＰ—ｍｅｄｉａｔｄｅ　Ｃａ２　ｒｅｌｅａｓｅ　ｆｒｏｍ　ＩＰ３一　ｉｎｓｅｎｓｉｉｔｖｅ　Ｃａ２　ｓｔｏｒｅｓ　ｉｎ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｎｓｃｌｅ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏ１．１９９８．２７４：ｌ　１９９—１２０５．　［９　Ｊ　Ｍａｙｔｅ　Ｍ，Ｃａｒｍｅｎ　ＤＬ，ｓｉｌｖｉａ　ＧＦ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ—　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｃ　ｅｒｌｅａｓｅ　ｂｙ　ｐｏｔｅｉｎ　ｋｎａｓｅ　Ｃ．Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇ　Ｃｈｅｍ．２００３．　２７８：４９９７２－４９９７９．　【ｌＯ］Ｐａｒｅｋｈ　ＡＢ，Ｐｅｎｎｅｒ　Ｒ．Ｓｔｏｒｅ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎｆｌｕｘ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ，１９９７．７７：９Ｏｌ－９３Ｏ．　【ｌ１］Ｓｃｈｏｔ　Ｃ，Ｂｏｒｇｅｒ　Ｊ，Ｍａｄｅｒ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ　ａｎｄ　ｄｉａｚｏｘｉｄｅ　ｍｏｄｕｌａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃ・ｌｉｎｋｅｄ　Ｃａ２　一ｓｉｎｇａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂ—ｃｅｉｌｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｅｎｄａｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，２０００，２７８：　Ｅ６３９．Ｅ６４７．　【ｌ２］Ｋａｇｎａｌｎ　ＳＭ．ｃＡＭＰ　ｉｈｎｉｂｉｓｔ　ＩＰ３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃａ２　ｒｅｌｅａｓｅ　ｂｙ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉｌａ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＧＭＰ・ｐｒｉｍｅｄ　ＰＫＧ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇａｓｔｏｒｉｎｔｅｓｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｄ．２００ｌ，２８Ｉ：１２３８．１２４５．　【ｌ３］Ｙｏｕｎｇ　ＳＨ．ｗｕ　ｖＳ．Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ　Ｅ．Ｃａ２　一ｓｔｉｍｕｌａｔｄｅ　Ｃａ２　ｏｓｃｉｌａｔｉｏｎｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｃａ２　一ｓｅｎｓｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｅｒｑｕｉｅｒ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００３，２７７：　４６８７ｌ　８７６．　【ｌ４］Ｏｒｌｉｎｅ　Ｂ，ＢｒｉｎａＨ．ＪａｍｅｓＬＫ。ｅｔａ１．ＳａｎｄｅｒｓａｎｄＫ＋ｃｈａｎｎｅｌｓｉｓ　ｅｒｇｕｌａｔｄｅ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　Ｃａ２　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏ１．２００１．２８ｌ：　ｌ５１２—１５２３．　［１５　Ｊ　Ｃｏｄａｚｚｉ　Ｆ，Ｔｅｒｕｅｌ　ＭＮ．Ｍｅｙｅｒ　Ｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　Ｃａ２　ｏｓｃｉｌａｔｉｏ１１８　ｎａｄ　ｗａｖｅｓ　ｂｙ　ｏｓｃｉｌａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｌｃａａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉ０ｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏ１．２００１．１ｌ：１０８９一ｌＯ９７．　［Ｉ６］Ｙｕｅ　Ｃ，Ｋｕ　ＣＹ，Ｉｊｕ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｈｎｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｎｓｅ　Ｃ－３　ｂｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２００ｏ．２７５：３０２２ｏ－３０２２５．　［１７］Ｈａｊｎａｃｚｋｙ　Ｇ，Ｄａｖｉｅｓ　Ｅ，Ｍａｄｅｓｈ　Ｍ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｉｎｇａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｃａｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００３，３０４：４４５－４５４．　［１８］Ｈａｄｄｏｃｋ　ＲＥ，Ｈｉｌ　ＣＥ．Ｄｌｆｉｅｒｅｎｔｉｌａ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｂｖ　ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｌ，４，５－ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＰ３）．ａｎｄ　ｒｙａｎｏｄｉｎｅ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｔｏｒｅｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｂａｓｉｌａｒ　ａｒｔｅｒｙ　ｖａｓｏｍｏｔｉｏｎ．Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏ１．２００２．　５４５：６ｌ５．６２７．　［１９］Ａｈｍａｄ　Ｍ，Ｌｅｉｌａ　Ｎ．Ｈｅｒｂｅｒｔ　ＹＧ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉａｍａｎｔ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｓ０ｕｒｃｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ￣ｌｉｎｅ　ｌｏｗｅｒ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｓｌｉｎｇ　ｍｕｓｃｌｅ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇａｓｔｏｒｉｎｔｅｓｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，２８６：　Ｇ２７ｌ—Ｇ２７７．　（收稿日期：２００６－０９－０５）　（本文编辑：李伟）