白血病随机扩增多态DNA分析及其临床意义
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李昕权 李丰益(1) 廖清奎(1) 罗春华(1) 北京军事医学科学院附属医院 提要 为探讨随机扩增多态DNA(RAPD)技术分析急性白血病基因组多态性特征及其临床意义,采用10种随机引物对急性白血病进行RAPD分析和选择特征引物进行临床观察。结果显示:急性淋巴白血病与急性髓细胞白血病各自有特征的RAPD标记,可以在DNA水平判别各类型白血病。RAPD标记可能用于白血病的基因分型,微小残留病检测等研究。
关键词 白血病 DNA 随机扩增多态 随机扩增多态DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技术是90年代Williams等人发展起来的一种新的遗传分析技术(1,2),RAPD是建立在PCR基础上,利用单个短脱氧核苷酸引物,对所分析的基因组进行随机扩增,经电泳检测被扩增DNA片段的多态性,即RAPD标记。RAPD标记的数目和大小反映了基因组内相应区域DNA的多态性,客观代表基因组之间的差异,其符合孟德尔遗传规律。RAPD技术具有分析快速、简便的优点。已渗透到有关遗传研究的各个领域。在植物、生动物、昆虫及人类学研究中,取得许多有意义的成果,故适用于各种生物基因组的研究。
白血病是造血细胞恶性克隆性疾病,其基因组内存在染色体异常,原癌基因及抗癌基因的突变、缺失等各种遗传变异,因而构成不同的多态性特征,这些变异可反映白血病细胞的一些生物信息,可能作为白血病的一种分子标记进行分析。目前,临床在对急性白血病细胞形态、组织化学、免疫表型及染色体等检查的基础上,基因水平上主要以免疫
*邮编 100039
(1)华西医科大学附属二院
球蛋白、T细胞受体、维甲酸受体及髓过氧化物酶等细胞谱系相关的基因分析,作为急性白血病诊断分型相关的基因标记(3),适用于一定分化类型的白血病。而在部分白血病,尤其是杂合性及未分化型白血病的结果难以进一步分析。本文探索用RAPD技术分析急性白血病基因多态特征及RAPD标记的临床应用的价值。
RAPD为白血病基因多态性的研究,提供了简便的手段。该技术采用不同序列的9-10碱基随机引物,通过聚合酶链反应(PCR)对所分析的基因组DNA进行扩增,再经电泳检测扩增DNA片段,即RAPD标记。得到的相应扩增区域内DNA多态性特征,可用于各白血病细胞基因组DNA多态性的分析。
材料和方法
1.骨髓细胞标本 根据FAB分型诊断标准,14例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者初诊期骨髓标本14份,缓解期标本4份。12例急性髓细胞白血病(AML)初诊期标本12
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份。正常骨髓标本6份。白血病细胞株K562、Namalva各一份。
2.标本处理 骨髓液用肝素抗凝,淋巴细胞分离液(比重1.077)离心分离单个核细胞,PBS制备成单细胞悬液。初诊期细胞再涂片,瑞氏染色后镜检90%以上为幼稚细胞。白血病细胞株经培养后收集细胞,PBS制成单细胞悬液,然后提取DNA,按常规方法进行(4)。
3.PCR扩增 RAPD反应体系体积25ul,含有10mmol/Ltris-HC1PH8.3,50mmol/LKC1,2.0mmol/LMgCL,100umol/LdNTPs,0.5umol/L引物,50ngDNA模板,1.5单位TaqD-NA聚合酶。采用PTC-100DNA扩增仪进行扩增。RAPD反应包括94e变性1min,36e退火1min,72e延伸2min,总计40个循环,最后于72e延伸5min。每次均设空白对照。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶电泳,2.5V/cm,1小时,化乙锭染色,紫外灯下观察记录。10个随机引物为基因公司产品(RAPDkit1),见附表。
附表 RAPD分析结果
引物12345678910
碱基序列(5.-3.)GTAGACCCGTCCTTGACGCATTCCCCCGCTTCCGCTCTGGGGAGGGTGTTTTTGCCCGGAAGGGAACGAGCCACAGCAGTACCCCCGAAGGGACCCTTAC
RAPD标记数
0~20~31~30~10~22~32~42~30~10~2
结果
1.RAPD分析结果 实验用10个引物扩增获得良好的扩增结果。各引物扩增的DNA片段数目在0~4个之间,大小介于0.4~2.0Kb之间,见附表。电泳结果见多数扩增位点为多态性,表现为DNA片段数目和大小的不同,根据电泳检测有清晰DNA条带的病例(ALL10/14例,AML8/12例)标本分析,RAPD标记可以区别ALL、AML及正常标本。2.RAPD特征标记比较 根据10个引物扩增结果分析,ALL与AML各自具有特征的RAPD标记。ALL病例扩增片段平均18.5?4.2条,平均每个引物1.8条。AML病例扩增片段平均16.5?4.5条,平均每个引物1.65条。正常骨髓标本扩增片段平均14?3.2条,平均每个引物1.4条。细胞株namalva扩增16条,每个引物平均1.6。K562扩增18条,平均每个引物1.8条。结合电泳分析DNA片段大小不同,各标本之间有明显的差异,反映了各自的多态性特征。以SI分析RAPD标记见,ALL与淋巴细胞白血病细胞株Namalva之间的SI为66.7%,AML与髓细胞白血病细胞株K562之间的SI为62.7%,正常标本与ALL及AML之间的SI分别为30.2%和25.4%,而ALL和AML之间的SI为40%。
3.RAPD标记临床观察 在6例ALL分析见引物4(TCCGCTCTGG)扩增出较一致的0.9kb的片段。以此为特征标记对2例ALL患者在临床治疗中进行RAPD分析,观察见1例在化疗缓解后该片段消失,同时病情处于临床缓解状态。另1例经治疗临床获缓解后2个月连续2次检测到该片段,并且在1个月后病情复发。
讨
论
4.RAPD结果分析 记录电泳分离清晰的DNA条带。对ALL、AML、白血病细胞株等标本的RAPD结果进行相似指数(SI)分析
(5)
。根据公式:Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)@
100%。其中Nxy为比较二标本共有的DNA片段数目,Nx及Ny分别为比较二标本各自的DNA片段数目。
RAPD分析采用单个随机引物进行,所设计的引物不必事先知道DNA核苷酸序列,但有一定原则遵循,即G+C含量在50-
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80%,10-20个碱基长度,不含回文结构(1,2)。所以说是某种意义上的通用引物,适用于各种生物基因组多态性分析。RAPD引物序列各不相同,但任一引物在所分析的基因组内部都有特定的互补部位,只要该部位序列符合PCR反应条件,即可能扩增出相应DNA片段。如果引物扩增区域内部序列发生插入、缺失等突变,引物互补位点分布发生改变,RAPD产物会有增有减,或分子量发生改变。因此,RAPD标记客观反映了基因组多态性的变异。每一种生物的RAPD标记为该生物所特有,是按孟德尔方式遗传的、有用的分子标记。本文筛选10种随机引物进行分析研究,在多数病例获得清晰的RAPD标记,ALL和AML二类白血病之间显示明显不同的多态性特征,从RAPD图谱分析比较,ALL与白血病细胞系Namalva之间及AML与K562白血病细胞系之间的SI相近,而与正常标本的SI差异明显,提示RAPD标记可能为白血病研究的一种遗传标记。
白血病是恶性克隆性增殖性疾病。引物4分析ALL表现出较特异的单态0.9kb片段,以该RAPD片段为标记,在2例ALL病例临床中观察,其中1例化疗获临床缓解后检
测到该片段,而后病情复发。另1例缓解后未检测到该片段,观察处于临床持续缓解。结果提示,RAPD标记可能用于微小残留病的检测。由于病例较少,还需要进一步研究。RAPD技术是一简便的分析白血病基因多态性的方法,如能增加引物数目和扩大研究例数,并借助计算机图象分析,将可能提高RAPD分析的精确度,用于白血病的基因分型,造血干细胞移植后植入证据的鉴定,微小残留病的检测等。
参
考
文
献
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(上接第248页)
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chemotherapy,3caseswithmethylationallshowednonremission;and3showedcompleteremission,23showedpartialremission,2showednonremissionin28caseswithnonmthylation(thetotaleffectiverateswere92.86%).Conclusion(1)Thefrequencyofmethylationofp16genewaslow,anditmightnotthemainpathogenesisinchildhoodwithprimaryAL.(2)Weshouldpayattentiontotheresultsthatthefre-quencyofmethylationofp16genewassignificantlyhigherincasesofchildhoodwithrelapseAL.Andthemethylationofp16genemayplayanimportantroleforguidingtreatmentandprognosticatingprogressionandprognosis.
Originalarticleonpage(246)THEEFFECTSOFCMVONTHEADHESIONOFBONEMARROWSTROMALCELLSFROMACUTELYMPHOBLASTICLEUKEMIAHuangYun,etal.PediatricDepartmentoftheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversityofMedicalSciences
TheexpressionofadhesionmoleculesICAM-1andVCAM-1onacutelymphoblasticleukemia(ALL)bonemarrowstromalcellsinfectedbycytomegalovirus(CMV)wasdetectedbyflowcytometry.TheresultsshowedthatCMVcouldinfectALLbonemarrowstromalfibrlblasts,1000TCID50CMVcouldnotdestroytheALLbonemarrowstromalcellsapparently.AttheearlystageofCMVinfection,theex-pressionofICAM-1onALLbonemarrowstromalcellsincreased,atthelatestageofCMVinfection,theexpressionofICAM-1onALLbonemarrowstromalcellsdecreased.TheexpressionofVCAM-1onALLbonemarrowstromalcellswasnotalteredbyCMVinfection.Inconclusion,CMVcanregulatetheexpressionofadhesionmoleculeICAM-1intwoways.
Originalarticleonpage(249)RANDOMAMPLIFIEDPOLYMORPHICDNAANALYSISINLEUKEMIAANDITSCLINI-CALSIGNIFICANCELiXinquan,etal.AffiliatedHospital,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100039
ObstractObjective:ToexploringgeneticpolymorphisofacuteleukemiabyusingrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)techniqueanditsclinicalsignificance.Method:RAPDtechniquewithtenrandomprimers.ClinicalfindingsandspecificRAPDmarkeranalysis.Results:ThecharacterRAPDmarkerswereobservedbetweenacutelymphoblasticandmyelogenousleukemia.ThespecificRAPDmarkercouldbeusedtomonitorresidualleukemiccellsinclinicalpractice.Conclusion:TheRAPDmarkersmightbepotentialtestindetectionofminimalresidualdiseaseandleukemicgeneticclassifica-tion.
Originalarticleonpage(252)THESTUDYONTHEGLUCOCORTICOID-INDUCEDAPOPTOSISOFTHEPERIPHERALBLOODLYMPHOCYTESFROMCHILDRENWITHACUTEIDIOPATHICTHROMBOCY-TOPENICPURPURAINVITROWangKaiyan,etal.TongjiMedicalUniversityTongjiHospitalDe-partmentofPediatrics
Objective:Thepresentstudywasdesgnedtodeterminetheeffectoftheglucocorticoid-inducedapoptosisoftheperipheralbloodlymphocytes(PBLs)fromchildrenwithacuteidiopathicthrombocy-topenicpurpura(AITP)invitro.Methods:ThePBLsfrom6childrenwithAITPbeforetreatmentwrecu-l
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