细胞毒性试验中两种细胞计数方法的比较

医学动物防制２０１６年１２月第３２卷第１２期Ｊ　Ｍｅｄ　Ｐｅｓｔ　Ｃｏｎｔｍｌ，Ｄｅｃ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　・ｌ３１３・　ｄｏｉ：１０．７６２９／ｙｘｄｗｆｚ２０１６１２００５　・论著・　细胞毒性试验中两种细胞计数方法的比较　高梅　，曹冲　，马会　，朱春花　，贾庆文　１．山东省药学科学院，山东省化学药物重点实验室，济南２５０１０１；　２．山东师范大学　摘要：目的　比较Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪法和传统显微镜计数法两种计数方法在细胞毒性试验中细胞计数的差异。　方法选用常见的两种类型的药品稀释液，稀释液为真溶液的注射用左旋泮托拉唑钠和稀释液为混悬液的毛蚶提取　物，设立不同剂量组，细胞染毒６　ｈ后制备细胞悬液，台盼蓝染色，分别用显微镜和Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪计数，　对结果进行比较分析。结果Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪法和显微镜计数法两种计数方法相关性良好，细胞计数结果差　Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪法是相对简单、快捷、准确的细胞计数方法。　文章编号：１００３—６２４５（２０１６）１２—１３１３—０４　异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论中图分类号：Ｒ４４６．１１　３　关键词：细胞毒性试验；Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数；显微镜计数法；台盼蓝；计数　文献标识码：Ａ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ＧＡＯ　Ｍｅｉ’，ＣＡＯ　Ｃｈｏｎｇ，ＭＡ　Ｈｕｉ，ＺＨＵ　Ｃｈｕｎ—ｈｕａ，ＪＩＡ　Ｑｉｎｇ—ｗｅｎ　’Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｃｅ　ｎＫｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆ　ｏＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｒｕｇ，Ｊｉｎａｎ　２５０１０１，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯＭｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ，Ｃｏｕｎｔｓｔｒ　ａａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｄｒｕｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ，ｄｉｌｕｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｕｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｌｅｆｔ—ｈａｎｄｅｄ　ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｄｉｌｕｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｓｃａｐｈａｒｃａ　ｓｕｂｃｒｅｎａｔａ，　ｂｏｔｈ　ｏｆ　ｈｅｍ　ｗｅｒｅ　ｓｅｔ　ｄｉｆｔｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ，ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ａｆｔｅｒ　ｃｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ａｔ　６　ｈ，　ｔｈｅｎ　ｗｅ　ｃｏｕｎｔ　ｗｉｈ　ｍａｔｎｕａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏ－　ｓｃｏｐｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｒｅｌａｒｉｖｉｔｙ，ｎｏ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｉｓ　ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ　ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ；Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ；Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ；Ｃｏｕｎｔ　体外哺乳动物细胞染色体畸变试验中，对于可溶　性的有细胞毒性的受试物，首先要确定受试物的试验　剂量（浓度），最高剂量应根据受试物的半数抑制浓　度（ＩＣ卯）确定，细胞的半数抑制浓度可通过活细胞计　可行性，并对这两种方法进行比较分析。　１材料与方法　１．１　细胞株中国仓鼠肺细胞（ＣＨＬ细胞），购自中　数、ＭＴｒ法等方法来确定　Ｊ。目前对于采用何种方　法来进行细胞计数没有统一的标准与要求，常用的细　国科学院上海生命科学研究院。　１．２　主要试剂　注射用左旋泮托拉唑钠由山东省药　学科学院提供，批号１４０５０９；毛蚶提取物由山东省　药学科学院中医药研究所提供，批号１４０３１９；改良　型ＲＰＭＩ一１６４０培养基购自赛默飞世尔生物化学制品　（北京）有限公司，批号ＮＺＦ１１６１；新生牛血清购自　浙江天杭生物科技有限公司，批号１３０１０５；台盼蓝　购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司，批号２０１４０３１２。　１．３主要仪器Ｔｈｅｒｍｏ　３１１１二氧化碳细胞培养箱，　胞计数方法为传统显微镜计数法，还有报道用自动细　胞计数仪法、流式细胞仪法等　卜ｍ　Ｊ。本研究选用常　见的两种类型的药品稀释液，稀释液为真溶液的注射　用左旋泮托拉唑钠和稀释液为混悬液的毛蚶提取物，　分别染毒６　ｈ进行细胞计数，研究不同稀释液类型下　Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪法代替传统显微镜计数法的　基金项目：山东省自主创新及成果转化专项（２０１４ＺＺＣＸ０２１０４）　产自Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ公司；ＢＤＳ２００倒置生物显微　作者简介：高梅（１９８３一），女，主管药师，研究方向：药物安全性评价　通讯作者：高梅，Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｍｅｉ７２９＠１６３．ｃｏｉｎ　镜，产自重庆奥特光学仪器有限责任公司；ＤＭ　ＬＳ２　显微镜，产自德国Ｌｅｉｃａ公司；ＳＷ—ＣＪ一２ＦＸＳ超净　工作台，产自苏州佳宝净化工程设备有限公司；　・１３１４・　医学动物防制２０１６年１２月第３２卷第１２期Ｊ　Ｍｅｄ　Ｐｅｓｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｄｅｃ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　ＸＢ．Ｋ．２５血球计数板，产自上海市求精生化试剂仪　器有限公司；ＩＣ　１０００　Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪，产　自上海瑞钰生物科技有限公司。　１．４　方法　１．４．１细胞准备将传代培养的ＣＨＬ细胞用０．２５％　胰蛋白酶消化处理，制备成细胞悬液接种至２４孔板　中，接种浓度为２０×１０　／ｍｌ。　１．４．２　细胞悬液制备将注射用左旋泮托拉唑钠配制　成１．０００　ｍｇ／ｍｌ、０．５００　ｍｇ／ｍｌ、０．２５０　ｍｇ／ｍｌ、０．１２５　ｍｇ／ｍｌ、０．０６３　ｍｇ／ｎ￣、０．０３２　ｍｇ／ｒｎｌ　６个剂量组，阴性　对照为ＲＰＭＩ培养基。毛蚶提取物配制成５．００　ｍｇ／ｒｎｌ、　２　５０　ｍｇ／ｍｌ、１．２５　ｍｇ／ｍｌ　０．６３　ｍｇ／ｍｌ、０．３２　ｍｇ／ｍｌ　０．１６　ｍｇ／ｍｌ　６个剂量组。将上述剂量分别加入不同的　孔中，培养６　ｈ。培养结束后弃去培养液，制成均匀的　细胞悬液，与０．４％台盼蓝染液１：１混合染色。　１．４．３细胞计数　１．４．３．１　血球计数法７５％酒精棉签清洁盖玻片及　计数板，再用干纱布或棉签擦一遍，在计数区上盖上　盖玻片。用移液器从经吹打混匀的细胞悬液中取１０　ｌ至盖玻片边缘至计数板周边，使其充满计数板和　盖玻片之间的间隙，静置片刻，将细胞计数板放置于　显微镜的载物台上夹稳计数，计数时按对角线方位，　数左上、左下、右上、右下的４个大方格（即１００小　格）的数量。为了保证计数的准确性，避免重复计数　和漏记，计数时数上线不数下线，数左线不数右线，　有两个或两个以上的细胞组成的细胞团按单个细胞计　算。显微镜下观察，凡着色的细胞均为不健康或已死　亡的细胞，不着色者为活细胞ｕ　，血球计数板计数。　每个浓度各计数３次后取均值。　细胞计数公式：细胞数／ｍｌ＝（４大格细胞总数／　４）×１０　×稀释倍数。　１．４．３．２　Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪法双击“Ｃｏｕ－　ｎｔｓｔａｒ”快捷图标启动Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ软件，点击控制软件　中的“计数模式”按钮，根据样本类型选择细胞模　式，点击“样品测量”按钮进入检测窗口，输入特　定的样本ＩＤ，输入样本的稀释比例，选择样本的细　胞类型，即可进行计数测量。将细胞悬液与台盼蓝混　匀染色后，吸取２０　ｌ样本加入Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ计数板对应　的样本槽中。将计数板插入载物台中，确保计数板的　第一个槽进人Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ计数仪检测位置。调节右侧　位置旋钮，将计数板调节到适当的位置，计数板移动　到检测位置时会听到定位声，此时对应位置的指示灯　亮。点击“开始测量”按钮开始进行检测，每个样　本各取３个视野位置进行计数。对可疑计数结果进行　人工修正分析。　１．５统计学方法数据采用ＤＡＳ　１．０进行分析，以　均值±标准差（孟±ｓ）表示。结果均采用配对ｔ检验及　相关性分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２　结果　２．１稀释液为真溶液　２．１．１　细胞计数结果分析显微镜下观察，当注　射用左旋泮托拉唑钠浓度为１．０００　ｍｇ／ｍｌ时，细胞　已死亡破碎，无存活细胞；浓度为０．５００　ｍｇ／ｍｌ时，　有存活细胞，生长状态较阴性对照组差，存活细胞　与阴性对照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；　浓度为０．２５０、０．１２５　ｍｇ／ｍｌ时，细胞计数与阴性对　照组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５）；　浓度为０．０６３、０．０３２　ｍｇ／ｍｌ时，细胞计数与阴性对　照组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。计数结果　显示，注射用左旋泮托拉唑钠浓度在０．０００—０．５００　ｍｇ／ｍｌ范围内，显微镜法与仪器法两种计数方法相　关性良好，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。浓度为　１．０００　ｍｇ／ｍｌ时，人工显微镜计数法显示细胞计数　结果为０，与镜下观察结果一致；Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细　胞计数仪计数仍有少量活细胞，通过细胞计数图片　观察并无活细胞，但是计数背景有大量颗粒及细胞　碎片，因折光率可能与活细胞相似，仪器误判为活　细胞。通过人工修正后，细胞计数结果为０（见表　１）。在以后的数据统计分析中把浓度为１．０００　ｍｇ／　ｍｌ的计数结果剔除。　表１　注射用左旋泮托拉唑钠仪器法与显微镜法　两种计数方法计数结果比较　注：　偏差＝仪器法一显微镜法／仪器法×１００％；仪器法、显微镜法细胞计　数结果与各自阴性对照组比较，　Ｐ＜ｎ０５，”Ｐ＜Ｑ０１。　医学动物防制２０１６年１２月第３２卷第１２期Ｊ　Ｎｅｄ　Ｐｅｓｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｄｅｅ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　・１３１５・　ｊ置Ｉ　２．１．２两种计数方法细胞毒性　以显微镜法为横坐　，目ｌ　玲，Ｏ　表３毛蚶提取物仪器法与　显微镜法两种计数方法计数结果比较　标，仪器法为纵坐标，做一元回归方程，比较两种计　数方法的相关性（见图１）。以细胞浓度为横坐标，计　数的细胞数为纵坐标，做线性回归方程，并用ＤＡＳ　１．０软件计算两种计数方法的Ｉｃ　。（见表２）。可看出，　两种计数方法相关性良好，　值为０．９　９２１。两种方　法测得的Ｉｃ　。值也极其相近，说明无论采取哪种计数　方法，都不会对后续的染色体畸变试验剂量的确定造　成影响。　Ｏ　ｌｏ　∞　∞　∞　图１两种计数方法的比较　表２仪器法与显微镜法两种计数方法细胞毒性比较　２．２稀释液为混悬液　２．２．１　细胞计数结果分析显微镜下观察，当毛蚶　提取物浓度为５．ｏ０、２．５０、１．２５、０．６３、０．３２、０．１６　ｍｇ／ｍｌ时，细胞均存活，生长状态较阴性对照组无明　显差别，但背景颜色较深，存在药物颗粒。人工修正　前，Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪计数量活细胞数量多于　人工显微镜计数法，通过细胞计数图片观察，计数背　景有大量颗粒，因折光率可能与活细胞相似，仪器误　判为活细胞，通过人工修正后，仪器法与显微镜法两　种计数方法相关性良好，差异无统计学意义（Ｐ＞　０．０５）（见表３）。　注：　偏差＝仪器法一显微镜法／仪器法×１００％。　２．２．２两种计数方法细胞毒性　以显微镜法为横坐　标，仪器法为纵坐标，做一元回归方程，比较两种计　数方法的相关性（见图２）。可看出，两种计数方法相　关性良好，　值为０．８　６９５。两种方法结果表明，各　剂量组细胞计数结果与各自阴性对照比较，差异均无　统计学意义（Ｐ＞０．０５），表明毛蚶提取物对ＣＨＬ细　胞无细胞毒性作用。　图２两种计数方法的比较　・１３ｌ６・　医学动物防制２０１６年ｌ２月第３２卷第１２期Ｊ　Ｍｅｄ　Ｐｅｓｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｄｅｃ　２０１６，Ｖｏ１．３２，Ｎｏ．１２　３讨论　人工显微镜细胞计数具有方法简单、检测成本低　等优势，但操作繁琐、速度慢，易受检测人的经验及　主观影响，且工作强度大，不适宜用于大样本量的检　测。Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪通过台盼蓝染色，通过　设定仪器的背景对比参数、死活判断参数、细胞状态　参数、团块连接参数等参数，在细胞计数的同时能够　检测出细胞的活性，包括总细胞浓度、活细胞浓度、　死细胞浓度、细胞活率、平均直径、平均圆度以及结　团率等，２０　ｓ就可快速检测出结果，且测试结果具有　可重复性。细胞计数的图片可直接在计算机中预览或　查看，并可通过ＪＰＥＧ的格式导出，检测结果可通过　ＸＬＳ和ＰＤＦ文件形式输出，方便用于进一步的数据　统计处理及数据保存。　本试验结果表明，仪器法与显微镜法细胞计数差　异无统计学意义，且两种方法相关良好，但在计数的　细胞数量上仪器法高于显微镜法，细胞数量越少偏差　越大，这与报道的仪器计数一般会高于显微镜计数一　致　，因其会计数一些细胞形态的颗粒，人工修正后　准确率仍然很高。Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪可检测的　细胞浓度范围为ｌ　Ｘ　１０　／ｍｌ～３　Ｘ　１０　／ｍｌ，当检测标本　中细胞数量达到了仪器的检测下限，偏差增大。注射　用左旋泮托拉唑钠浓度为１．０００　ｍｓ／ｍ１时，两种方法　计数有差异，分析原因可能为当注射用左旋泮托拉唑　钠浓度为１．０００　ｍｇ／ｍｌ时，细胞全部死亡破碎，细胞　存活率为０，计数已超过计数仪的下限；另一原因为测　试标本中有诸多颗粒及细胞碎片，影响检测结果，导　致检测的存活率偏高。毛蚶提取物稀释液为混悬液，　计数时有药物残留颗粒，因折光率可能与活细胞相似，　仪器误判为活细胞，导致检测的存活率偏高。此种情　况下，都应使用仪器的人工修正分析功能，在检测图　片中根据观察，删除明显的细胞碎片及杂质，修正后　重新测试结果。此外，如果检测标本中细胞数量超过　仪器检测浓度范围，则应对所测样本进行合理稀释或　富集处理后再计数，以确保测量结果偏差率最小。因　此，表明Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪在做好性能验证、　严格按照仪器操作规程操作的前提下，仪器法对细胞的　检测可信度良好，可用于细胞计数分析，这与报道的的　计数仪可用于酵母细胞计数结论一致　。使用自动细胞　计数仪大大减轻了检测人员的工作强度，减少了主观　性，特别适用于连续测定，给试验带来了方便和快捷，　缩短了试验时间，但是也不应完全摒弃显微镜计数法，　特别是当细胞毒性较高、存在大量死亡细胞及细胞碎片　时，又或是样本中有残留药物颗粒时，在自动细胞仪不　能读数和存在疑问时建议采用显微镜计数法　Ｈ　引。　参考文献　［１］国家食品药品监督管理总局．药物遗传毒性研究技术指导原则．　２００７—１０—２３．　［２］袁伯俊，王治乔．新药临床前安全性评价与实践［Ｍ］．北京：　军事医学科学出版社，１９９７：８９—１０２．　［３］袁伯俊，廖明阳，李波．药物毒理学实验方法与技术［Ｍ］．北　京：化学工业出版社，２００７：２６８—２７１．　［４］ＨｏｒｉＨ，Ｔａｋａｙａｎａｇｉ　Ｔ，ＫａｍａｄａＹ，　以Ｇｅｎｏｔｏｘｉｅｉｔｙ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅ８ａ－　ｍｉｎ　ａｎｄ　ｅｐｉｓｅｓａｍｉｎ［Ｊ］．Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ，２０１１，７１９（１—２）：２１—２８．　［５］Ｚｈａｎｇ　Ｔ，Ｑｉｎａ　Ｌ，Ｔａｎｇ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｅｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｏ—　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌ—ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｏａｔｅｄ　ｉｒｏｎ　ｏｘｉｄｅ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎａｎｏｓｃｉ　Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，１２（３）：２８６６—２８７３．　［６］唐浩，商澎，骞爱荣，等．肿瘤转移体外实验中细胞计数方法探　讨［Ｊ］．第四军医大学学报，２００４，２５（７）：５９６—５９９．　［７］侯建军，黄邦钦，戴相辉．赤潮藻细胞计数方法比较研究［Ｊ］．　中国公共卫生，２００４，２０（８）：９０７—９０８．　［８］王小林，王宇，吴永华．ＸＥ一２１００全自动血液分析仪自动幼稚粒　细胞计数与显微镜方法比较［Ｊ］．现代检验医学杂志，２００６，２１　（６）：６２—６３．　［９］陈金详．网织红细胞计数方法探讨［Ｊ］．中国自然医学杂志，　２００７，９（３）：２６３．　［１０］翟唯钢，魏方林，刘梅凤，等．藻类生长抑制试验中藻细胞计　数方法比较［Ｊ］．农药，２０１３，５２（７）：４９７—５０２．　［１１］彭双清，郝卫东．药物安全性评价关键计数［Ｍ］．北京：军事　医学科学出版社，２０１３：２３８—２３９．　［１２］李筱梅，付秋英，程志忠，等．２种网织红细胞计数方法的比较　［Ｊ］．临床检验杂志，２００５，２３（２）：１３４．　［１３］陈晖．Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ自动细胞计数仪与传统酵母计数方法的对比试验　研究［Ｊ］．啤酒科技，２０１２，４（４）：４１—４４．　［１４］张丽丽，杨慧娟，于嘉屏．结核感染Ｔ细胞斑点实验中两种细　胞计数方法的对比分析［Ｊ］．国际检验医学杂志，２０１２，３３　（１３）：１６３８～１６３９．　［１５］贾红彦，潘丽萍，杜博平，等．　一干扰素释放试验中两种细胞计数　方法的对比分析［Ｊ］．临床军医杂志，２０１４，４２（７）：７４９—７５１．　（收稿日期：２０１６—０３—２９）