全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测

原创2017-03-08

蛋白磷酸化是一种重要的翻译后修饰方式，调控广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯等。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。

传统的检测蛋白磷酸化的方法： • 放射性同位素标记 • Western Blot

• 酶联免疫吸附分析（ELISA）

• 流式细胞仪和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC/IHC）

• 质谱——由于磷酸化蛋白的信号较弱，目前还具有一定的难度。 需要特异性的磷酸化抗体！！！

可是，没有磷酸化抗体怎么办呢？

Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子，可取代传统的酶免疫法和放射性同位素法，用来分离和检测磷酸化蛋白。

有两类：

Phos-tag Acrylamide和Phos-tag Biotin。 Phos-tag Acrylamide Phos-tag Acrylamide

分离：SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白

该方法可以在同一个电泳条带里面同时观察靶蛋白的不同磷酸化状态，以及外因引起的磷酸化状态的改变。

有老师可能会问，这么好用的产品，怎么操作呢？

只要在配置SDS-PAGE胶的时候，将phos-tag配成的溶液加入分离胶里面，就配置成Phos-tag聚丙烯酰胺凝胶了，后续用跟常规SDS-PAGE一样的步骤进行操作就可以，用起来简单的呢。

如果想进一步确认一下分开的这些条带是不是你要的蛋白，可以用常规的抗体来确认（常规抗体就可以代替多个磷酸化抗体哦，省时省钱又省力）。

详细的protocol可见APExBIO官网哦！ 特点

• 非放射性元素，非荧光物质

• 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带 • 操作简便，与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似

• Phos-tag 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关

• Phos-tag SDS-PAGE实验后，可进行常规的免疫组化、质谱等 • 性质稳定，溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月 • 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测

• 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来 应用举例

Phos-tag Biotin

Phos-tag Biotin

检测：代替western blot检测中的磷酸化抗体

原理如上图所示：先使用常规的方法，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后Phos-tag Biotin就可以跟膜上磷酸化蛋白的磷酸根结合，接着加入HRP耦联的链霉素，再加入底物进行显色，就可以检测我们的磷酸化蛋白了！如果你研究的蛋白没有相应的磷酸化抗体可以使用，就可以尝试用这个方法啦！

应用举例

如图所示：图A：加入磷酸酶，磷酸化蛋白水平下降，而没有加磷酸酶的磷酸化蛋白水平较高。图B：加入PKA，磷酸化蛋白水平增加，而没有加PKA的磷酸化蛋白水平较低。而检测这种磷酸化状态的改变用的就是Phos-tag Biotin。 特点

• 无辐射

• 无需PVDF膜的封闭处理

• Phos-tag的特异性结合与氨基酸种类、序列无关 • 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续工作 • Phos-tag-BTL母液可稳定保存至少6个月 • 实验流程与使用HRP标记抗体相类似