细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用

维普资讯 http://www.cqvip.com Ｊｕ１．２００６　２２（４）４５５—４６２　神经解剖学杂志　（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）　细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用①　史娟圃（第四军医大学基础医学部　解剖学教研室，梁辣琚脑研究中心，西安７１００３２）　钙位于元素周期表中第２列，属于碱土金属。钙离子是　有关。除了ＶＤＣＣ，细胞上还存在受体激活的钙通道（ｒｅｃｅｐ—　ｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃａ“ｃｈａｎｎｅｌ种重要的二价阳离子，它和许多其它阳离子的物理学性质　ＲＡＣＣ），即通道的开放依赖于配体　非常相似，但具有独特的生物学功能。表现在，钙离子不仅　是电流的载体，作为二价阳离子维持胞内外电化学梯度，而　的参与。可分为配体门控型钙离子通道和代谢型钙离子通　道。配体门控型钙通道，离子通道本身就是受体，或是受体　复合物的一部分，如ＮＭＤＡＲ、部分ＡＭＰＡＲ、Ｐ２ＸＲ、５－ＨＴ３Ｒ　等　Ｊ。这些离子通道为非选择性的阳离子通道，主要对　Ｎａ　，Ｋ　通透，但也具有一定的钙离子通透性。代谢型离子　通道和Ｇ蛋白偶联受体（Ｇ　ｐｍｔ￣ｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｉｏｒ，ＧＰＣｒ）　通过Ｇ　．一ＰＬＣ信号转导通路相连。启动ＧＰＣＲ，可以导致　下游钙离子通道的开放。目前已有报道的有ｍＡＣｈＲ，　Ｐ２ＹＲ，ＮＡａｌＲ，ＳＰＲ偶联的离子通道等　。长期以来该通　且还是一种重要的细胞内第二信使，参与肌细胞收缩、腺细　胞分泌、神经递质释放、受精、细胞分化和程序死亡等过程。　事实上，真核生物几乎所有的细胞分子事件都有钙离子的参　与。　细胞内、外自由钙离子的分布很悬殊。组织液中一般为　几ｍｍｏｌ／Ｌ，而胞浆中的自由钙只有１００　ｎｍｏ￣Ｌ左右。细胞　内的钙离子分布也很不平衡，可以被各种细胞器贮存。从总　量上讲，胞内５０％的钙位于细胞核内，３０％位于线粒体内，　道的分子实体不详，并且在不同的细胞类型中具有不同的名　称，如ＣＡＮ（Ｃａ２　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｎｏｎ．ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃａｔｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅ１），ＣＲＩＣ　（Ｃａ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｃａ　ｅｎｔｒｙ），ＲＯＣＣ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｏｐｅｒａｔｅｄ　１４％位于内质网内，５％左右位于胞膜上，只有剩余的ｌ％左　右位于细胞质内…。其中，大部分还被胞浆内的各种缓冲　剂，如各种钙结合蛋白所螯合，真正的游离钙大概只占０．　Ｏｌ％左右。细胞内钙离子很重要，但也很危险。持续的钙升　高会和胞内重要的能量物质磷酸根结合形成沉淀而导致细　胞死亡…。　Ｃａ２　ｃｈａｎｎｅ１）和ＳＯＣＣ（ｓｔｏｒｅ　ｏｐｅｒａｔｅｄ　Ｃａ２　ｃｈａｎｎｅ１）　。瞬时　感受器电位（ＴＲＰ，ｔｒｎｓｉａｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａ１）通道家族的克　隆为这一领域打开了新的局面，成为这些通道的可能分子实　体　】。目前，各种在体代谢型钙通道和ＴＲＰ分子的对照性　研究是钙离子通道领域的热点之一。　除了胞膜上的这些钙通道外，能够引起胞内钙升高的还　有内质网或肌浆网上的ＩＰ３Ｒ和雷诺定受体（ＲｙＲ）　。它们　的特点是可以被Ｉ　或钙离子直接激活，而释放内钙。虽然　内质网中的钙浓度并不很高，但由于它体积庞大，延续于整　个胞浆内，所以钙释放造成的钙升高要比钙流入对某些细胞　功能，如肌细胞收缩的贡献更大。　细胞除了具有上述各种升高钙的途径，其本身也有很多　细胞对钙离子有一套完备的监控系统以维持钙的内稳　态平衡。细胞膜系统上有许多跟钙离子调控密切相关的蛋　白质。这些蛋白质位于细胞膜或细胞器膜上，可以允许细胞　外钙离子顺着浓度梯度进入细胞内，即钙内流，也可以帮助　细胞器中的储存钙释放至细胞浆，即内钙释放；膜系统上与　降钙相关的蛋白质拮抗着此升钙蛋白质的作用，二者共同维　持钙的分布平衡。　细胞膜上有很多和钙流入有关的通道和受体。最引人　注目就是电压门控性钙离子通道（ｖｏｌｔａｇｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃａｚ　ｃｈａｎｎｅｌ，ＶＤＣＣ）。ＶＤＣＣ存在于许多具有兴奋性的细胞膜表　面，如神经元、心肌、骨骼肌和平滑肌细胞上。它有很多亚　型。根据通道的生物物理特性和药理学特性，可以分为Ｌ，　Ｔ，Ｎ，Ｐ／Ｑ，Ｒ型　Ｊ。Ｌ型主要分布于骨骼肌细胞和心肌细　胞，与兴奋收缩偶联密切相关；Ｔ型在心肌和神经元中分布；　Ｎ型、Ｐ／Ｑ型和Ｒ型则主要在神经组织中分布，与递质释放　降钙的手段。钙离子离开胞浆而恢复静息水平主要依靠膜　系统上的钙主动转运系统，即钙泵　Ｊ。脂膜上的钙泵（ｐｌａｓ—　ｍａｌ　ｍｅｎｌＬｂｒａｎｅ　Ｃａ“．ＡＴＰａｓｅＰＭＣＡ）消耗一个ＡＴＰ可以逆着　浓度梯度泵出１．２个钙离子。内质网线粒体钙泵，与ＰＭＣＡ　相似，也可以逆着浓度梯度将胞浆钙收藏回细胞器。此外，　质膜上还有Ｎａ　／Ｃａ　交换体，以不耗能的方式转运进３个　Ｎａ　而转运出１个Ｃａｚ　。　①国家自然科学基金（Ｎｏ．３０４００１５４）资助项目　维普资讯 http://www.cqvip.com ４５６　神经解剖学杂志　第２２卷　第４期　２００６年７月　综上所述，细胞膜系统上有各种各样的膜蛋白，可以保　等　Ｊ。Ａｅｑｕｏｒｉｎ，即水母素，是应用最为广泛的生物发光蛋　白。它是由分子量为２２　ｋＤａ的脱辅基发光蛋白，ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａ．　ｚｉｎｅ发光团和氧分子组成的复合体　。一个复合体可以结　合３个钙离子。钙离子的结合可以释放氧分子，氧化ｃｏｅｌｅｎ．　ｔｅｒａｚｉｎｅ而发出波长４６５　ｎｍ的蓝色荧光。Ａｅｑｕｏｆｉｎ的这种发　证钙离子既发挥相应的生理功能，又维持一定的内稳态平　衡。维持此平衡的任何一个蛋白质突变或功能异常，都会导　致严重的病症。ＲｙＲ在骨骼肌细胞中的功能异常会导致恶　性体温升高而在心肌中表达下调，可导致心力衰竭；ＩＰ　Ｒ在　神经组织的自发突变会导致Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病；毛细胞质膜上钙　泵的突变导致耳聋　。既然这些蛋白质的功能如此重要，利　光反应的钙有效浓度范围在０．１｝ｘｍｏｌ／Ｌ一０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ之间，　可以用来测量大部分的细胞内钙事件。水母素用作钙指示　剂具有如下优缺点。首先，它是钙结合型蛋白复合体，钙离　子结合导致发光，不需要荧光激发系统，对设备的要求低，同　时，也不会因光照而产生细胞毒等副作用。它的缺点是不能　通透细胞膜，需要用微注射或转化表达的方式来负载细胞，　对实验者的技术要求较高。另外，它的量子效率低，对指示　剂的浓度要求大，同时也需要灵敏的光监测系统　。正是由　于以上各点的限制，用生物发光蛋白来作钙测定的研究已不　是主流。但通过基因工程手段改建水母素，将其和编码各种　细胞器前驱序列的基因相连，制成重组水母蛋白来测量细胞　器内的钙信号，则是目前生物发光蛋白的一个非常有前途的　应用所在　。　１．２化学荧光指示剂　用钙离子测定和成像技术对其进行研究和监控，不仅可以揭　示其发挥生理作用的机制而且可以阐明某些疾病的发病机　理。本文对钙离子测定和成像技术的基本原理从指示剂的　选择、负载、注意事项以及光学系统的发展几个方面加以综　述。　１．　钙指示剂　钙离子不可视。进行钙测定必须借助外界的某种可视　化物质作为它的标识物，这就是钙离子指示剂。钙指示剂都　是荧光物质，能够捕捉钙，与钙结合后发生荧光强度或波谱　性质的变化。它的发展大致经历了三个阶段：生物发光蛋　白。化学荧光指示剂和荧光蛋白指示剂。　１．１生物发光蛋白　生物发光蛋白是上个世纪６０年代从水母体内陆续发现　的钙结合型发光蛋白，包括ａｅｑｕｏｆｉｎ、ｏｂｅｌｉｎ、ｍｉｔｒｏｃｏｍｉｎ、ｃｌｙｔｉｎ　化学荧光指示剂是由Ｔｓｉｅｎ和他的同事于上世纪８Ｏ年　表１　常见的化学荧光钙指示剂各项参数　注：部分摘自Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ａ　ｅｔ　ａｌ［　维普资讯 http://www.cqvip.com

史娟等：细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用　４５７　代研发出来的一系列化合物　”　，目前已有１００多种，表１　列出了一些常用的钙指示剂。它们大都是钙螯合剂ＥＧＴＡ　或ＢＡＰＴＡ的类似物，是在其分子结构的基础上加上了一些　苯环结构而制成的，如Ｑｕｉｎ　２、Ｉｎｄｏ　１和Ｆｕｒａ　２等。这类指示　剂种类繁多，有不同的分类方法。（１）根据测光原理和所得　数据的性质，可分为比值型和非比值型（单波长型）。除Ｉｎｄｏ　１、Ｆｕｒａ　２、Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚａ和ＢＴＣ等少数系列外，化学荧光指示剂　大都为非比值型染料。（２）根据激发光波长可以分为紫外　光型和可见光型。前者包括Ｑｕｉｎ　２、Ｉｎｄｏ　１、Ｆｕｒａ　２等，数目较　中，比值型染料数目较少，但应用广泛。图１为两种常用的　比值型染料Ｉｎｄｏ　１（图１Ａ）和Ｆｕｒａ　２（图１Ｂ）在不同钙浓度　下的发射光谱和激发光谱曲线。对于Ｉｎｄｏ　１来说，随着钙离　子浓度的升高，钙结合态染料浓度上升，其在４０５　ｎｍ左右的　发射光波峰增强，在４８５　ｎｍ左右的发射光波峰降低。故　Ｆ　／Ｆ　可以作为钙变化的代表值。对于Ｆｕｒａ　２来说，随着　钙浓度的上升，胞内结合态染料浓度升高，其在３４０　ｎｍ左右　的吸收峰增强，而游离态染料吸收峰（３８０　ｎｍ左右）减弱。　强吸收导致强发射。故染料经３４０　ｎｍ激发后的发射光（５１０　少；后者数目多，包括Ｆｌｕｏ　３、钙绿和Ｒｈｏｄ　２等。（３）根据发　射波长可以分为蓝光型，如Ｉｎｄｏ　１；绿光型，如Ｆｕｒａ　２、Ｆｌｕｏ　３、　钙绿；黄／橙光型，如ｃａｌｃｉｕｍ　ｏｒａｎｇｅ，Ｒｈｏｄ　２；红光型，如钙深　红，Ｆｕｒａ　ｒｅｄ等。　１．２．１　化学荧光指示剂的参数　化学荧光指示剂的各项　参数如表１所示。　存在形式商品化的指示剂有三种形式：酸化，酯化和　葡聚糖化。选择购买指示剂时要充分考虑实验目的、条件以　及染料的负载方式，选择合适的商品化形式。其中，酸化和　葡聚糖化指示剂不能自由通透细胞膜，酯化指示剂可以自由　通透细胞膜，适合于培养细胞或急性分离的大批量细胞钙测　定。　光谱特性每一种染料都有四个光谱数值，即自由态和　钙结合态的激发波长和发射波长。大多数染料在钙游离和　钙结合状态下的光谱性质不发生变化，而只发生发射光强度　的变化，这是大多数非比值型染料的测光原理。据报道，Ｆｌｕｏ　３在结合钙离子后荧光强度可以增强４０～２００倍　。但Ｉｎ—　ｄｏ　１和Ｆｕｒａ　２系列等比值型染料不同，其中，Ｉｎｄｏ　１结合钙后　的发射光峰从４７５　ｎｍ变为４０１　ｌｌｍ，４０１　ｎｍ与４７５　ｎｍ的光　强之比可以作为钙信号的相对值，对于Ｆｕｒａ　２，它的激发波　峰在结合钙后从３６３　ｎｍ变为３３５　ｎｍ，而发射波长无明显变　化，因此，采用双波长两次相继激发，两次捕光的方式就可以　得到染料分别在钙结合态和游离态分别被激发时的发射光　强度，二者之比即为钙信号的相对值。　解离常数染料的另一个重要参数是　值，即解离常　数，它是选择染料时的另一个关键因素。符合［ｄｙｅ］＋　［Ｃａ“］＝［ｄｙｅ·Ｃａ　］可逆方程，其计算公式为：　Ｋ　＝『ｄｙｅ］×『Ｃａ　］／『ｄｙｅ·Ｃａ“］　染料的Ｋ　值不是一成不变的，可以随具体的实验环境　而上下波动。Ｋ　值越大，染料对钙的亲和力越低；Ｋ　值越小，　对钙的亲和力越大。一般认为待测钙信号的变化范围在Ｋ　值上下浮动时，染料的测钙性能发挥最好。　动力域染料的动力域为染料的最大荧光强度与最小　荧光强度（非比值型）或最大比值与最小比值（比值型）之　比，也即染料在无钙和钙饱和状态下的强度比或比值比。该　值越大，染料的信号可变度就越大，有利于数据的检出。在　这一点上，Ｉｎｄｏ　１、Ｆｕｒａ　２和Ｆｌｕｏ　３的动力域较大，这也是它　们广为应用的一个原因。　１．２．２　比值型和非比值型染料　在众多的化学荧光染料　ｎｍ）强度增强，而在３８０　ｎｍ激发后的发射光（５１０　ｎｍ）强度　减弱。因此，Ｆｕｒａ　２测钙所得数据为ＦⅫ／Ｆ　。需要指出的　是，此值和Ｉｎｄｏ　１的Ｆ　／Ｆ　５代表的含义不同。前者为３４０　ｎｍ和３８０　ｎｍ波长紫外激发时的发射光强度之比；后者为　４０５　ｎｍ和４８５　ｎｍ的发射光强度之比。　Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ）　Ｆｉｇ．１　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｌｎｄｏ　１　（Ａ）ａｎｄ　Ｆｕｒａ２（Ｂ）ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｆｒｅｅ　Ｃａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　（ｃｈａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｐｅｅｃｈ　ｏｆ　Ｍｉｙａｗａｋｉ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｄｉｇｉｔａｌ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｏｃｔ　２０—　２２，２００４）、　维普资讯 http://www.cqvip.com

４５８　神经解剖学杂志　第２２卷　第４期　２００６年７月　比值测定型染料是应用极为广泛的染料，它的数据形式　批细胞进行测钙，可以考虑酯质染料。而和膜片钳记录相结　合，则可以考虑染料的酸性形式。酸式染料分子量小，易于　通过膜片尖端扩散进细胞，且不容易发生染料的渗漏和区室　化（见４．４）。对一些较大的细胞如卵母细胞进行测钙，如果　操作者具备微注射技术，可以考虑葡聚糖偶联的染料。这种　染料直接注入细胞，可以精确控制染料的胞内浓度且不会发　生渗漏现象。　采取比例的方式，不受实验设备、光路组成、染料的负载浓　度、细胞类型和实验者个体操作等的限制。数据问具有很高　的可比性。另外，在测钙的过程中，活细胞在液流中难免会　有动态变化，如细胞的厚薄变化、染料在胞内重新分布变化　等。比值测量可以消除这些因素带来的影响，使测量结果具　有相当的准确性。最后，染料尤其是酯质染料在胞内的浓度　会随时间的变化出现波动（具体原因见下），比值型染料可以　消除此波动，忠实地反映细胞内钙信号的变化。正是由于以　上无可比拟的优点，比值型染料尤其是Ｆｕｒａ　２成为目前应用　最为广泛的化学荧光指示剂。但它也有自己的缺点，表现在　紫外激发，会导致组织产生一定的自发荧光，还会损害细胞　的能量代谢系统，而且不适合于大多数的激光共聚焦（ｃｏｎｆｏ－　ｃａｌ　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＬＳＭ）测钙系统等。这些不足　在一定程度上限制了染料的应用。　和比值型染料不同，非比值型染料的特点是染料在结合　钙后发生发射光强度的变化。该类染料多为可见光激发，自　发荧光小，对细胞的损害较小而且适用于ＣＬＳＭ系统。但其　数据直接为荧光强度值，易受染料浓度、细胞动态变化等因　素的影响。因此，目前很多学者倾向于用ＡＦ／Ｆ这种“假比　值”来衡量非比值型染料钙信号变化　卜　】。其计算公式为：　ＡＦ／Ｆ：（Ｆ－Ｆ　）／（Ｆ　—Ｂ）其中，Ｆ是实际检测值，Ｆ　是刺　激前胞内染料的荧光强度，Ｂ是细胞周围的背景噪音。这种　“假比值”可以在一定程度量化非比值型染料的测钙结果，但　其准确性、抗干扰性远不能和比值型染料相比。最近出现了　将两种非比值型染料如Ｆｌｕｏ　３和Ｆｕｒａ　Ｒｅｄ共同孵育细胞进　行测钙的研究　”ｊ。随着钙离子浓度的升高，当用４８８　ｎｍ　的激发光激发染料时，Ｆｌｕｏ　３和Ｆｕｒａ　Ｒｅｄ会发生不同的变　化：前者荧光强度增加，后者荧光强度减弱。因此，Ｆｎ帅，／　Ｆ　便可以用作比值来衡量钙信号变化而达到比值测量的　目的。但这一方法也有缺陷，即Ｆｌｕｏ　３和Ｆｕｒａ　ｒｅｄ毕竟分属　不同的染料个体，它们在胞内可能会随时间产生的不同的变　化倾向，导致其比值变化不似单一Ｆｕｒａ　２或Ｉｎｄｏ　１忠实可　靠。另外，Ｆｕｒａ　ｒｅｄ在４８８　ｎｍ激发时的量子产率很低，荧光　强度很弱。因此，往往要用比Ｆｌｕｏ　３高出２—３倍的浓度孵育　细胞才能得到好的信噪比。但由于其属于高亲和力染料，孵　育浓度过高，会导致高的钙缓冲效应。　１．２．３选择化学荧光指示剂的标准　基于以上的各点，　在选择化学荧光指示剂时应考虑以下几个因素。　光源的光谱性质　由于指示剂皆为荧光物质，需要激发　光，所以，光源所能提供的光谱范围应包含染料的激发波长。　这一点对汞灯和氙灯光源来说一般不存在问题，因为它们的　光谱在经过合适的滤光后都能满足紫外光和可见光范围内　的激发要求。但对于ＣＬＳＭ系统需要特别注意，因为目前所　常用的氩或氩氪激光器所提供的波长一般不包括紫外波段　的波长。　染料的商品化形式　实验方法和目的直接决定所要选　择的染料的化学形式，如单纯对培养细胞或对急性分离的成　染料的钙亲和度　一般情况下胞浆钙的变化是人们测　钙的主要目的。由于胞浆钙平均水平较低，可以选择解离常　数较小的高亲和力染料，如Ｉｎｄｏ　１、Ｆｕｒａ　２、Ｆｌｕｏ　３，钙绿，钙黄　和钙红等。而如测试者欲测量细胞器钙，则应该选择高Ｋ　值的低亲和力染料如Ｉｎｄｏ　１ＦＦ、Ｆｕｒａ　２ＦＦ、Ｆｌｕｏ　３ＦＦ、Ｒｈｏｄ　２、　Ｒｈｏｄ　５Ｎ等。一般待测钙变化符合０．１×Ｋ　＜［ｃａ２　］＜１０　×Ｋ　条件时，测钙效果最好。　染料的动力域在以上各条件的基础上，选择动力域大　的染料可以增强信噪比，有利于信号的检出。　１．３荧光蛋白钙指示剂　荧光蛋白钙指示剂是基于绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基础上　的钙指示剂。绿色荧光蛋白于１９６２年发现于水母体内，　１９９２年其编码基因被克隆　。随后，利用分子生物学突变　技术，蓝色（ＢＦＰ）、青色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、远红外荧光蛋　白（ＤｓＲｅｄ）相继出现，掀开了生物学领域的“绿色革命”。　荧光蛋白的一个直接应用就是研究生物大分子之间相　互作用或大分子本身构象变化的荧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓ—　ｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ。ＦＲＥＴ）技术。其基本原理　是：在一个大分子上偶联上荧光供体基因如ＢＦＰ，在与其作　用的另一个大分子上偶联上受体荧光蛋白如ＧＦＰ。当两个　分子没有结合时，在用ＢＦＰ的激发波去激发时，只有ＢＦＰ可　以发出蓝色荧光而ＧＦＰ只发出很微弱的荧光或不发光。但　当两个分子结合而且相互作用发生构象变化时，由于两个荧　光基团间的空间距离缩小。供体的发射的能量便可以转移至　受体，而使受体被激发发出自己的荧光。因此，供体的荧光　减弱而受体的荧光增强。这样，Ｆ一　／Ｆｄ０　就可以用来检测　两个分子间是否发生了相互作用。目前应用ＦＲＥＴ的荧光　蛋白配对有以下三对：ＢＦＰ－ＧＦＰ；ＣＦＰ—ＹＦＰ；ＧＦＰ－ＤｓＲｅｄ。　配对的有两个基本原则：（１）供体的激发波长和受体的激发　波长不能重叠过多，否则会发生交叉激发；（２）供体的发射波　长需和受体的激发波长有相当的重叠，否则能量转移不能进　行。　基于ＦＲＥＴ原理，Ｍｉｙａｗａｋｉ于１９９７年研制出了利用　ＦＲＥＴ测钙的分子系统，命名为ｃａｍｅｌｅｏｎ¨　。Ｃａｍｅｌｅｏｎ是用　分生手段构建的蛋白质复合体。它包括四个部分：钙调蛋白　（ＣａＭ），是最为普遍的细胞内钙受体，可以介导许多钙的生　物学效应；Ｍ１３，是肌球蛋白轻链激酶的２６个氨基酸序列，　可以和ＣａＭ结合；荧光供体ＢＦＰ或ＣＦＰ和受体ＧＦＰ或　ＹＦＰ。以ＣＦＰ　ｃａｌｎｅｌｅｏｎ为例，如Ｆｉｇ，２所示，ＣａＭ的一端连　接ＣＦＰ，另一端通过Ｍ１３连接ＹＦＰ。ＣａＭ的分子呈哑铃形，　两端的“ＥＦ手”结构可以分别结合两个钙离子。一旦和钙离　维普资讯 http://www.cqvip.com 史娟等：细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用　４５９　Ｃａ２　ＹＦＰ　ｌ　ｎｍ　Ｃａ２　ＣＦＰ　Ｆｉｇ．２　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｍｅｌｅｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｃａ“一ｉｍａｇｉｎｇ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ（ｃｈａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｍｉｙａｗａｋｉ　ｅｔ　ａｌ’。）　子结合，ＣａＭ会发生构象变化，其两端的“球形结构”向中间　靠拢，以Ｍ１３为纽带，ＹＦＰ和ＣＦＰ间的距离缩小而发生荧光　共振能量转移。这样，当用４４Ｏ　ｎｍ波长的蓝光激发时，ＣＦＰ　４８０　ｎｍ的青色荧光减弱而ＹＦＰ　５３０　ｎｍ的黄色荧光增强，利　用Ｆ　ｒＰ／Ｆ　ＦＰ便可以间接衡量细胞内钙信号的变化。　荧光蛋白指示剂与发光蛋白和化学染料相比有其优越　性。与发光蛋白相比，属于比值测定，且荧光信号强，对光子　监测系统要求低。与化学荧光剂比较，可以微注射或异源表　达测钙，染料的靶向定位好，可以测量特定的细胞器内的钙　信号，而且无渗漏现象。但它也有缺点，如信号的动力域窄　（Ｒ…／Ｒ　＜２），对ｐＨ值变化敏感等　铷川。　２．　钙指示剂的负载　指示剂只有成功地进入细胞，才有可能对钙信号进行监　控。负载指示剂的方法很多，在此介绍三种常用的方法。　２．１酯质载入　商品化的酯质染料带有乙酰甲酯（ＡＭ）尾，具有疏水性　可以被动地扩散至细胞内。ＡＭ染料对钙离子没有亲和性，　经细胞内的酯酶水解脱掉ＡＭ尾后才可以发挥指示剂的作　用。水解后的酸式染料为亲水性，不能扩散出细胞膜。所　以，染料最终可以不可逆地在细胞内达到很高的水平。酯质　染料的孵育条件因染料种类，细胞类型而有所不同。以Ｆｕｒａ　２　ＡＭ为例，对于培养细胞和急性分离的细胞，一般１～５　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ浓度室温孵育３０　ｍｉｎ，可以达到较好的负载效果。　在孵育的过程中，可以使用ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ一１２７或ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ　等助扩散剂，可以帮助疏水性的酯质染料均匀地扩散在细胞　外液中，提高负载效果　。脂质载入的优点是操作简便易　行，不需要专门的技术要求，而且能在较短的时间内获得很　高的染料浓度。缺点是受胞内酯酶的影响很大。如果酯酶　活性低，则水解率低，染料的终浓度就不会太高。而且，未能　及时水解的染料会在测量的过程中扩散，造成染料渗漏和区　室化。　２．２微注射法　该法针对膜不可通透性的染料，如酸式染料、葡聚糖偶　联染料以及蛋白质染料。将染料溶解在配制的细胞内液中　（内液成分尽可能与胞浆成分接近），灌注至玻璃微管，徐徐　注入细胞内。这种方法直接将染料注入细胞内，精确性高。　但对操作者的技术要求高，对细胞的损伤大，而且仅限于大　型细胞。不适合于成批细胞的钙测定。　２．３膜片尖端扩散法　该法是将电生理膜片钳记录和钙离子测定相结合时所　用的负载法。这种方法可以将电信号和钙信号相结合，对于　阐明某些受体、离子通道的生理功能非常具有说服力。将染　料溶在电极内液中，染料通过低阻抗玻璃微电极尖端和细胞　形成的传统全细胞封接口被动扩散进入细胞。利用这种方　法负载染料，可以针对任何一种染料形式。但酸式染料分子　量小，扩散快，效果最好。扩散进入的染料只存留于细胞浆，　不存在渗漏和区室化问题。但染料本身的扩散受很多条件　如细胞大小、电极尖端的大小、输入阻抗、系统阻力、内液粘　度和时间等因素的影响。大口径低阻抗（１～２　Ｍｎ，灌注正　常电极内液），系统阻力在ｌ０　Ｍｎ以下的小细胞的扩散相对　较快，５～１０　ｒａｉｎ即可达到较好的扩散效果，而小口径高阻　抗、高系统阻力、大细胞则需要较长的时间。　除了以上三种常用的负载法，染料的负载还有低钙法、　ＡＴＰ法、低渗透休克法、重力法、刮载法和脂转运法等　。　这些方法只是针对特定的细胞或组织、实验目的和条件时所　用的特定方法，不具有普遍性，不再赘述。　３．　钙离子浓度的校正方法　无论是比值型还是非比值型染料，测钙所得到的直接结　果都不是钙离子浓度，而是荧光强度值或比值。这就需要对　此测定值进行钙离子浓度的换算和校正。校正公式为：　［ｃａ２　】ｉ＝Ｋ　×（Ｆ—Ｆ　；　）／（Ｆ一一Ｆ）（非比值测量法）　［Ｃａ２　］　：Ｂ×Ｋｄ×（Ｒ—Ｒ　）／（Ｒ～一Ｒ）（比值测量法）　其中，Ｆ和Ｒ分别为测量所得的荧光强度值和比值，Ｆ　ｉ　和　Ｒ　、Ｆ一和Ｒ～分别是无钙和钙饱和时的强度值和比值。　Ｋ　是解离常数，Ｂ为比值中分母方波长在无钙和钙饱和时的　荧光强度之比，如对于Ｆｕｒａ　２来说，Ｂ＝Ｆ，８０　３８０　。　校正过程的关键是要制作校正曲线得到Ｋ　、Ｂ、Ｆ　ｉ　或　Ｒ　Ｆ一或Ｒ　。ＥＧＴＡ－Ｃａ２　缓冲液是最常用的校正液。校　正液可以商品化购买也可以自己制作。如Ａ液可以为ｌ０　ｍｍｏ］／Ｌ　ＥＧＴＡ，Ｂ液为１０　ｍｍｏ］／Ｌ　Ｃａ２　ＥＧＴＡ。两种缓冲液　的其他组分要完全一样。将Ａ液、Ｂ液按不同比例混合可以　得到一系列不同浓度的游离Ｃａ２　溶液。由于ＥＧＴＡ对Ｃａ　的解离常数已知，故ｃａ　缓冲液的Ｃａ２　浓度可以计算得出　（商品化的校正液都给出了此值）。将此缓冲液系列作为待　测物利用指示剂进行测钙，取得Ｆ、Ｒ值、Ｆ　＆Ｒ　；　和Ｆ一＆　Ｒ一值，而后按上述公式进行回归拟合。所得到的Ｂ和Ｋ　值　即可用来校正测钙所得到的Ｆ，Ｒ值。　虽然利用以上离体的方法可以对钙离子浓度进行定标，　维普资讯 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神经解剖学杂志　第２２卷　第４期　２００６年７月　但指示剂的性质在细胞外和细胞内往往有很大的不同，如受　胞内温度、ｐＨ和离子强度等的影响。因此，最精确的校正方　法就是在特定的细胞内进行在体校正。在体校正的常用方　法就是利用一些钙离子通道开放剂如ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、４一溴一Ａ一　２３１８７使细胞内钙浓度可以和细胞外达到平衡　。其具　对钙离子不敏感。染料褪色的直接影响就是信号强度随时　程的延长而基线下滑　。　。这在用单波长染料测钙时表现　得尤为明显。比值测定在一定程度上可以避免这一负面影　响。因此，必须摸索既可以获得良好的信噪比又可以缩短光　照时间的平衡点。克服染料褪色的另一个方法就是在灌流　体的方法也是要制作或购买含有不同游离钙浓度的系列缓　冲液。其中含有低浓度的ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ。这样细胞外的游离钙　就可以在ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ的帮助下进入细胞内，使细胞内的游离　钙浓度已知。而后按照上述方法，可以得到染料的各种参数　值而对某一具体的测定进行校正。除此而外，在体校正还可　以用微注射缓冲液的方法来进行，但这种方法会改变细胞内　环境而产生误差。　钙离子浓度的校正是指示剂测钙的一个很重要的方面，　但目前很多学者在用比值法测钙时已倾向于不进行定标而　直接使用测量值进行结果的描述，也已为大家所接受。这是　比值测量法的又一个优点。　４．　钙离子测定的潜在问题和解决方法　钙离子测定虽然操作过程简单，技术难度低，但在对结　果的衡量和评估时有很多潜在的问题点需要考虑和分析。　４．１细胞内缓冲效应　所有的钙指示剂都是钙离子的螯合物。钙离子与之结　合虽然会改变指示剂的发光强度或波谱性质，但反过来指示　剂也会对钙离子的微弱变化进行缓冲。这一点在高亲和力　染料如Ｑｕｉｎ　２、Ｆｕｒａ　２、钙绿等尤为明显　。Ｑｕｉｎ　２现在甚　至经常被用来衡量细胞内的钙缓冲力　。　。因此在利用这　些高亲和力染料进行测钙时，合适的浓度、孵育温度和时间　控制很关键。切忌孵育浓度过高和时间过长造成染料的高　浓度聚集。　４．２自发荧光　很多的细胞内组分可以发出自发荧光，如一些结缔组织　成分和胶原纤维等。但它们的影响一般不很大。细胞内最　严重的自发荧光干扰来自腺嘌呤核苷（ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰ）和黄　素腺嘌呤核苷（ＦＭＮ，ＦＡＤ）。ＮＡＤＰ被还原生成ＮＡＤＨ，其自　发荧光增强，而ＦＭＮ被氧化生成ＦＡＤ发出自发荧光　川。　ＮＡＤＨ的激发波长和发射波长分别是３４０　ｎｌＴｌ和４４Ｏ～４７０　ｎｍ，ＦＡＤ的激发和发射波长分别是４５０　ｎｍ和５３０～５５０　ｎｍ。　因此，对于一些紫外激发的短波长指示剂如Ｆｕｒａ　２和Ｉｎｄｏ　１　估计自发荧光对实际测量结果的污染状况尤为关键。克服　这一问题的一个方法就是在指示剂负载前记录待测细胞的　背景荧光，而后从实际测量结果中减去此背景值。使用一些　长波长指示剂也可避免自发荧光污染。　４．３细胞毒和染料的褪色　指示剂属于外来物质，长时间的滞留对细胞多少具有毒　害作用。这主要表现在对细胞呼吸和增殖的抑制作用。有　报道表明罗丹明一１２３可以滞留在癌细胞和心肌细胞的线粒　体内影响其氧化还原反应的进行，而Ｆｌｕｏ　３负载的海胆卵细　胞不能进行正常的发育　”　。另外，长时程的光照可以导致　染料的褪色，即指示剂本身发生某种变化而变得对激发光或　液中加入抗氧化剂或在测定台上充盈氮气以达到隔绝氧气　的作用　。　４．４染料的区室化　区室化是利用化学荧光指示剂测钙时的一个非常普遍　和重要的问题。它是指染料被某些细胞器捕获而没有均匀　地分布在胞浆中。由于细胞器中的钙信号变化和胞浆中有　很大的不同，故染料的区室化可以影响最终的胞浆钙信号。　区室化受负载条件、细胞类型和染料种类的影响。同一种染　料在不同的细胞中可能会聚集到不同的细胞器中。利用洋　地黄皂苷或Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００处理细胞增加膜的通透性，使胞浆　内的染料外流就可以显示染料区室化的程度　。染料区室　化可能由细胞器上阴离子转运系统介导，也可以因酯质染料　在胞浆内不完全水解而被动扩散至细胞器内形成　。另　外，当胞浆内的酯酶活性低于细胞器内时，竞争的失败也可　以导致染料的区室化　Ｊ。由于染料的区室化都是由酶一蛋白　质系统介导，属生化反应，对温度很敏感。因此，预防的一个　措施就是降低孵育和测钙温度。　４．５染料的渗漏　染料可以从细胞内渗漏至细胞外。其机制和区室化相　似，由质膜上的阴离子转运系统和染料的不完全水解造成。　克服染料渗漏的有效方法包括：（１）选择电负性弱的染料，例　如钙绿由于比Ｆｕｒａ　２多一个正电荷，其渗漏现象弱于Ｆｕｒａ　２；（２）选择抗渗漏型染料，如Ｆｕｒａ　ＰＥ３、Ｉｎｄｏ　ＰＥ３、Ｆｌｕｏ　ＬＲ　等。这些染料在母体染料的基础上加上了哌嗪环，后者在细　胞内可以质子化达到抗渗漏的目的；（３）选择葡聚糖偶联的　染料或通过膜片尖端源源不断地负载染料。　５．　钙测定光学系统的发展　钙测定的发展除了伴随指示剂的发展外，光学系统的变　迁也是一个重要方面。最初也是直到现在还广泛使用的是　传统广视野倒置显微镜监测系统，它的特点是工作距离长，　能够在载物台上加载各种各样的辅助设备，并且可以和电生　理记录相结合。它的缺点就是使用场光源，由于光散射，在　所观察的视野内，样品上的每一点都同时被照射并成像，入　射光可以照射到整个细胞，细胞的整个发射光都可以通过物　镜而成像，使图像的清晰度和分辨率降低。这种测钙方式适　合于大强度、广范围的钙信号，而不太适合于低强度、局域性　定位的钙信号。如前所述，胞内钙信号有严密的调控机制。　许多在体细胞中的钙事件都是小范围、局域化的，因此，传统　的监测系统难以对这种精细的钙信号进行分析和研究。　激光共聚焦显微镜的出现给钙测定领域带来了新的契　机。它采用激光束作光源，激光束通过照明针孔和物镜以聚　焦的方式对标本进行层层扫描而收集钙信号，在此过程中，　焦平面以外的散射光线不能通过探测针孔而使测得的钙信　维普资讯 http://www.cqvip.com 史娟等：细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用　４６ｌ　号具有很强的空间分辨率。这一优点使微弱的局域性钙信　号测量成为可能。但大多数的ＣＬＳＭ系统使用氩或氩氪激　光作为光源，这两种激光的激发波长范围目前比较局限，不　Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｒｅｓ，１９９８；３４：Ｊ６１一Ｊ７９　［４］史娟，李继硕．ＴＲＰ离子通道．神经解剖学杂志，２００４；２０：１９７　２Ｏ４　适合于短波长指示剂的使用，而且由于层层扫描，ＣＬＳＭ测钙　的时间分辨率较低。　最近，双光子激发激光扫描镜术（ＴＰＬＳＭ）也被应用于　［５］Ｍｉｓｓｉａｅｎ　Ｌ，Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ　Ｗ，Ｖａｎ　Ｄｅｎ　Ｂｏｃｓｈ　Ｌ　ｅｔ　ａ１．Ａｂｎｏｒｍａｌ　ｉｎ—　ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ“ｈｏｍｅ￣ｔｓｉａｓ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅＣｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，２０００；２８：　ｌ一２ｌ　钙测定系统中。ＴＰＬＳＭ可以同时发射两个光子照射荧光标　本，由于波长和能量成反比，ＴＰＬＳＭ可以用原激发波长２倍　［６］Ｓｈｉｍｏｍｕｍ　Ｏ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅａ：ｐｈｏｔｏｐｍｔｅｉｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ．　Ｓｙｍｐ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，１９８５；３９：３５１—３７２　的激光激发荧光染料。这种长波长激发对于减轻染料的细　胞毒，细胞自发荧光和保持标本的活性很有帮助。另外，　ＴＰＬＳＭ与ＣＬＳＭ具有相似的空间分辨率。但它的原理是。由　于被两个光子同时激发的几率与光子密度的平方成反比，远　离聚焦平面的标本不能被双光子激发而导致高的空间分辨　率。　结语　在过去的二、三十年中，钙测定无论是从指示剂的选择　还是光学监测系统方面都获得了快速的发展。现在，细胞内　钙离子测定已经成为一项研究细胞分子功能的常规技术。　但尽管如此，如何针对特定的细胞钙事件选择合适的指示剂　和成像元件仍然是测钙的首要任务。在指示剂方面，虽然水　母发光蛋白在信号强度、时间分辨率及信号监测系统上处于　劣势，但它无需荧光激发系统；化学荧光指示剂虽然种类繁　多，性质多样，适合于各个成像系统，应用最为广泛，但它有　自身难以克服的缺陷如缓冲力、区室化和需要荧光激发等；　而利用ＦＲＥＴ原理和分生手段构建的ｃａｍｅｌｅｏｎ测钙系统虽　然具有敏感，准确等优点，但它需要复杂的表达系统而且对　酸碱度高度敏感。钙测定研究在光学监测方面，从传统的广　视野显微镜术，到激光共聚焦显微镜术到双光子显微镜术，　钙信号的采集和摄取正朝着局域化、高的时空分辨率的方向　发展。这些发展将有助于揭开钙离子生理和病理作用的奥　秘，为人类认识自身和克服疾病提供技术支持。另外，最近，　种高通量钙离子测定术正悄然兴起，它对样本实施微板多　孔分析，同时可以监测９６、３８４乃至１５３６个不同的钙信号，　大大地缩短了测量时间，提高了工作效率　。该技术对于　需要同时检测多种钙信号的用户，尤其是对于药物公司在初　期阶段新药的筛选和开发无疑是一个福音。　（收稿２００５—０６—２０）　参考文献　［１］王春梅，黄晓峰，杨家骥等主编．激光扫描共聚焦显微镜术．　西安：第四军医大学出版社，２００４　［２］Ｋｏｃｈｅｇａｒｕｖ　ＡＡ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｖｏｌｔａｇｅ—ｇａｔｅｄ　ｃａｌ—　ｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，　２００３；３３：１４５—１６２　［３］ｌｎｏｕｅ　Ｒ，ｈｏ　Ｙ．Ｎｏｎ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃａｔｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌ（ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ）．Ｊ　［７］Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ　Ｏ，Ｍｕｓｉｃｋｉ　Ｂ，Ｋｉｓｈｉ　Ｙ．Ｓｅｍｉ—ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａｃｑｕｏｒｉｎ：ａｌｌ　ｉｍｐｍｖｅｄ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．　Ｂｉｃｏｈｅｍ　Ｊ，１９８８；２５１：４０５—４１０　［８］Ｋｅｎｄａｌｌ　ＪＭ，Ｂａｄｍｉｎｔｏｎ　ＭＮ．Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｅｅｎｃｅ　ｍｏｖｅｓ　ｉｎｔｏ　ａｎ　ｅｘｃｉｔｉｎｇ　ｎｅｗ　ｅｒａ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８；１６：２１６　２２４　［９］Ｔｓｉｅｎ　ＲＹ．Ｎｅｗ　ｃａｌｃｉｕｍｉｎｄｉｃａｔｏｒｓａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒｓｗｉｔｈ　ｈｉ【ｈｇｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｇａａｉｎｓｔ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｏｎｓ：ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０；１９：２３９６—２４０４　［１０］Ｔｓｉｅｎ　ＲＹ．Ａ　ｎｏｎ—ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｂｕｆｅｒｓ　ｎａｄ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８１；２９０：５２７—５２８　［１１］Ｔｓｉｅｎ　ＲＹ，Ｐｏｚｚａｎ　Ｔ，Ｒｉｎｋ　ＴＪ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｉｎｔｃａｔ　ｌｙｒｅ—　ｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｃｙｔｏｐｌｓａｍｉｃ　ｆｒｅｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ—　ｌａｄｙ　ｔｒａｐｐｅｄ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ１．１９８２；９４：３２５—３３４　［１２］Ｈａｒｋｉｎｓ　ＡＢ，Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ　Ｎ，Ｂａｙｌｏｒ　ＳＭ．Ｒｅｓｔｉｎｇ　ｍｙｏｐｌａｓｍｉｃ　ｆｒｅｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎ　ｆｒｏｇ　ｓｋｄｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｆｉｂｅｒｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏ－３．Ｂｉｏ－　ｐｈｙｓ　Ｊ．１９９３；６５：８６５—８８１　［１３］Ｃｈｅｎｇ　Ｈ，Ｌｅｄｅｌ￣ｒ　Ｊ，Ｃａｎｎｅｌｌ　ＭＢ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｐａｓ：ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｅ—　ｖｅｎｔｓ　ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ—ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｍｕｓｃｌｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６２：７４０—７４４　［１４］Ｌｉｐｐ　Ｐ，Ｎｉｇｇｌｉ　Ｅ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ２　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ　ｆｒｏｍ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｐａｔｔｅｍｓ　ｒｅ—　ｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｆｃｏａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，１９９４；７４：９７９－９９Ｏ　［１５］Ｎｅｗｍａｎ　ＥＡ，ｇａｈｓ　ＫＲ．Ｃａｌｃｉｕｍ　ｗａｖｅｓ　ｉｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｓ｜ｉｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ—　ｅｎｃｅ．１９９７；２７５：８４４—８４７　［１６］Ｍａｒｓｈａｌｌ　ＩＣ，Ｏｗｅｎ　ＤＥ，Ｃｒｉｐｐｓ　ＴＶ　ｅｔ　ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｎｉｌｌｏｉｄ　ｒｅ—　ｃｅｐｔｏｒ　１　ｂｙ　ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａｔｏｘｉｎ　ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｆｒｏｍ　ｉｎｏｓｉｔｏｌ　１，４，５一　ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｔｏｒｅｓ．Ｂｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００３；１３８：１７２一　ｌ７６　［１７］Ｗａｌｃｚｙｓｋｏ　Ｐ，Ｗａｇｎｅｒ　Ｅ，Ａｌｂｒｅｃｈｔｏｖａ　ＪＴ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｃｏ—ｌａｏｄｅｄ　Ｆｌｕｏ－３　ｎａｄ　Ｆｕｒａ　Ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅ　ｃｙｔｏｓｅｌｉｃＣａ２　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌｉｖｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，　２０００；２８：２３—３２　［１８］ＰｒａｓｈｅｒＤＣ，Ｅｃｋｅｎｒｕｄｅ　ＶＫ，Ｗａｒｄｗｗ　ｅｔ　ａ１．Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｕｒｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　ｇｒｅｅｎ—ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅ，１９９２；１１１：２２９　２３３　［１９］Ｍｉｙａｗａｋｉ　ＡＪ，Ｌｌｏｐｓｉ　Ｒ，Ｈｅｉｍ　ＪＭ　ｅｔ　ａ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｃａ２　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｃａｌｍｅｄｕｌｉｎＮａｔｕｒｅ，　１９９７；３８８：８８２—８８７　［２０］Ｋｎｅｅｎ　Ｍ，Ｆａｒｉｎａｓ　Ｊ，“Ｙ　ｅｔ　ａ１．Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐＨ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｊ，１９９８；７４：１５９１　ｌ５９９　［２１］Ｍｉｅｓｅｎｂｏｃｋ　Ｇ，ＤＥ　Ａｎｇｅｌｉｓ　ＧＤＡ，Ｒｏｔｈｍａｎ　ＪＥ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ　ｓｅｃｒｅ—　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｙｎａｐｔｉｃ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐＨ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　维普资讯 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４６２　神经解剖学杂志　第２２卷　第４期　２００６年７月　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８；３９４：１９２—１９５　［２２］ＭａｒｕｙａｍａＩ．ＨａｓｅｇａｗａＴ，ＹａｍａｍｏｔｏＴ　ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ一　１２７　ｏｎ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｒａ　２／ＡＭ　ｉｎｔｏ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｓｏｌａ—　ｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｔａｅｎｉａ　ｃｏｌｉ．Ｊ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｓｃｉ，１９８９；１４：１５３—１６３　［２３］Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ａ．Ｃａｍａｃｈｏ　Ｐ．Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒ　ＪＤ　ｅｔ　ａ１．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆｉｎ—　ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ．１９９９；７９：１０８９—１　１２５　［２４］Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ　Ｇ．Ｐｏｅｎｉｅ　Ｍ．Ｔｓｉｅｎ　ＲＹ．Ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　ｇｒｅａｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８５；２６０：３４４０—３４５０　［２５］ｘｕ　Ｔ．Ｙａｎｇ　Ｗ，Ｈｕｏ　ＸＬ　ｅｔ　ａ１．Ａｂｎｏｒｍａｌ　ｓｐｅｃｔｒａ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｏｂ—　ｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　Ｔｒｉｔｏｎ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ［ｃａ　］ｉ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕ·　ｏｒｅｓｅｅｎｃｅ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｆｕｒａ－２．Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。２００４；５８：　２１９—２２６　［２６］Ａｂｒａｍｏｖ　ＡＹ，Ｄｕｃｈｅｎ　ＭＲ．Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆｉｏｎｏｍｙｃｉｎ，４－ＢｒＡ２３１８７　ａｎｄ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｌｅｃｔｏｒｇｅｎｉｃ　Ｃａ“ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　ｏｎ　ｍｉｔｃｏｈｏｎｄｒｉａ　ｉｎ　ｉｎｔａｃｔ　ｃｅｌｌｓＣｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ．２００３；３３：１０１—１１２　［２７］Ａｌｏｎｓｅ　ＭＴ，Ｃｈａｍｅｒｏ　Ｐ，Ｖｉｌｌｌａｏｂｅｓ　Ｃ　ｅｔ　ａ１．Ｆｕｒａ－２　ｍｌｔａｇｕｎｉｓｅｓ　ｃａ１．　ｃｉｕｍ·ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｒｅｌｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ．２００３；３３：２７—３５　［２８］Ｃａｒｔｅｒ　ＴＤ，Ｏｇｄｅｎ　Ｄ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆＣａ“ｒｅｌｅａｓｅ　ｂｙ　ＩｎｓＰ３　ｉｎ　ｐｉｇ　ｓｉｎ—　ｇｌｅ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌａ　ｃｅｌｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｃｙ·　ｔｏｓｏｌｉｃ　Ｃａ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ　ｅｖｏｋｅｄ　Ｃａ“ｓｐｉｋｅ．Ｊ　Ｐｈｙｓｉ—　ｏ１．１９９７；５０４：１７—３３　［２９］Ｓｕ＃Ｋ，Ｍｕｓｃｈ　ＭＷ，Ｄｉ　Ａ　ａ／．Ｏｘｉｄａｎｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ　Ｃａ“一ａｎｄ　ｃＡＭＰ—ｓｔｉｎ｜ｕｌａｔｅｄ　ＣＩ’ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ＂１＇８４　ｃｅｌｌｓ．　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。２００１：１２０：８９—９８　［３０］Ｐａｄｄｌｅ　ＢＭ．Ａ　ｃｙｔｏｐｌｓａｍｉｃ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｐｙｒｉｄｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｆｌｕｏ·　ｅｒｓｅｅｎｃｅ　ｉｎ　ｒａｔ　ｄｉａｐｈｒａｇｍ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｗｉｈｔ　ｆｌａｖｏ－　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｐｆｌｉｌｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ，１９８５；４０４：３２６—３３１　［３１］Ｃｒｃｏｅ　ＡＣ．Ｆｅｒｒｉｇｎｏ　Ａ，Ｖａｉｅｒｔｔｉ　Ｍ　ｅｔ　ａ１．Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｏｐｅｒ－　ｔｉｅｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｒａｔ　ｈｅｐａｔｃｏｙｔｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．　Ｐｈｏｔｃｏｈｅｍ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．２０ｏ４；３：９２０—９２６　［３２］Ｓｕｍｍｅｒｈａｙｅｓ　ＩＣ，Ｌａｍｐｉｄｉｓ　ＴＪ．Ｂｅｍａｌ　ＳＤ　ｅｔ　ａ１．Ｕｎｕｓｕａｌ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３　ｂｙ　ｍｉｔｃｏｈｏｎｄｒｉａ　ｉｎ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｎｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌ１．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ。１９８２；７９：５２５９—５２９６　［３３］Ｓｔｒｉｃｋｅｒ　ＳＡ，Ｃｅｎｔｏｎｚｅ　ＶＥ，Ｐａｄｄｏｃｋ　ＳＷ　ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｆｃｏａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｉｎ　ｓｏｓ　ｕｒｃｈｉｎ　ｅｇｇｓ．Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ，１９９２；１４９：３７０—３８０　［３４］Ｓｃｈｅｅｎｅｎ　ＷＪ，Ｍａｋｉｎｇｓ　ＬＲ，Ｇｒｏｓｓ　ＬＲ　ｅｔ　ａ１．Ｐｈｏｔｄｏｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｏ—ｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ａｐｐａｒｅｎｔ　Ｃａ“ｃｏｎｃｅｎｔａｒｔｉｏｎｓＣｈｅｍ　Ｂｉｏ１．　１９９６：３：７６５—７７４　［３５］Ｂｅｃｋｅｒ　ＰＬ，Ｆａｙ　ＦＳ．Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ　ｏｆｆｕｒａ－２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｄｅ—　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８７；２５３：　Ｃ６ｌ３一Ｃ６ｌ８　［３６］Ｋａｏ　ＪＰ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆｍｅａｓｕｒｉｎｇ［ｃａ　］ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｉｎ—　ｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ。ｌ９９４；４０：１５５—１８ｌ　［３７］ⅨⅥＩ苫ｉｌｉｏ　Ｆ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＴＨ，Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ　ＳＣ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｆｕｒａ－２ｓｏ—　ｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｗｉｈｔ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔａｒｎｓｐｏｒｔ　ｂｌｏｃｋｅｒｓ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ。１９９０；ｌｌ：５７—６２　［３８］Ｇｕｎｍｒ　ＴＥ，Ｒｅｓｔｒｅｐｏ　Ｄ，Ｇｕｎｍｒ　ＫＫ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｓｔｅｒｉｉｆｄｅ　ｆｕｒａ一　２　ａｎｄ　ｉｎｄｏ．１　ｔｏ　Ｃａ　一ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｆｏｒｍｓ　ｂｙ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉ—　ｏ１．１９８８；２５５：Ｃ３Ｏ４一Ｃ３ｌ０　［３９］Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ　ＳＦ，Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ　ＪＰ，ＡＩｔＡｗｑａｔｉ　Ｑ．Ｆｕｒａ－２　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｓ　ｌｃｏａｌｉｚｅｄ　ｔｏ　ｍｉｔｃｏｈｏｎｄｒｉａ　ｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８７；　２５３：Ｃ７４４一Ｃ７４７　［４０］Ｍｏｎｔｅｉｈｔ　ＧＲ，Ｂｉｒｄ　ＧＳ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｈｉｇｈ·ｈｔｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃａ２　．ｂａｃｋ　ｔｏ　ｂａｓｉｃｓＴｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ。２００５；　２６　２ｌ８—２２３