丝状真菌实验室诊断及药敏分析35例

２５６　世界最新医学信息文摘２０１４年第１４卷第１期　・医学检验・　丝状真菌实验室诊断及药敏分析３５例　２．黑龙江省医院感染内科，黑龙江哈尔滨１５００３６）　（１．黑龙江省医院实验诊断部，黑龙江哈尔滨１５００００；　施中凯　，胡晓丽　，杜英　，　苏秀丽　，朱鹏飞　，陈岩　摘要：目的对患者深部分离的真菌进行检测和耐药性分析，了解患者深部真菌感染的现状，为临床感染性疾病提供病　原学诊断和合理使用抗真菌药物的依据。方法患者血液、无菌体液培养、分离出的菌株用棉蓝染色直接镜检和培养相　结合的方法进行鉴定及药敏试验。结果在１８２９份血液和无菌体液标本中，分离丝状真菌３５株，阳性率１．９％；其中　以烟曲霉茵感染为主，检出前３位的科室为重症监护病房（１ＣＵ）、肝胆外科和血液科；分离的菌株对药物的敏感性分别　为氟康唑９１．４％、５．氟胞嘧啶８８．６％、伊曲康唑７１．４％、两性霉素Ｂ１００．０％。结论血液和无菌体液中分离的丝状真菌　以烟曲霉菌最多见，药敏结果显示对伊曲康唑的耐药性增加。　关键词：丝状真茵；诊断；药敏分析　中图分类号：Ｒ４４６　文献标识码：Ｂ　ＤＯ１　１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—３１４１．２０１４．０１．１９３　本文对１８２９份血液和无菌体液标本培养、分离、鉴定。　０引言　近年来，随着糖皮质激素、免疫抑制剂和高效广谱抗菌　药物的广泛应用，器官移植和其他介入性治疗的普遍开展，　以及艾滋病患者的不断增加，深部丝状真菌的感染逐年增　多。在上世纪八十年代，酵母菌（如白念）是引起深部真菌　感染的主要病原菌，近来的研究显示，丝状真菌引起的深　部感染越来越多，甚至在某些特定人群中有赶超酵母菌的　趋势　】。由于这些菌种对临床常用的抗真菌药物耐药或不敏　感，所以该类菌种的感染病死率较高，并且深部真菌感染　缺乏特征性的临床症状，难以在发病早期获得病原学诊断，　当患者出现持续高热而抗生素数日无效时，往往提示真菌感　染已经扩散到数个器官口　。因此，在患者发病早期即能做出　快速准确的诊断，对挽救深部真菌感染患者的生命有重大意　义。本文统计分析了来自２０１１年ｌ０月２０１２年４月北京协　和医院以及２０１２年４月至今黑龙江省医院的病原标本共计　３２例，依靠乳酸酚棉蓝染色观察丝状真菌孢子特点加以鉴　定，期望给临床丝状真菌感染的诊断带来帮助。　结果显示烟曲霉菌检出率为５７．１４％，黄曲霉菌为１４．２９％，　黑曲霉菌为８．５７％，土曲霉菌为５．７１％，其它丝状真菌各检　出１株。见表１。　表１　３５例丝状真菌鉴定构成比　２．２不同科室丝状真菌检出构成比　丝状真菌感染主要集中在ＩＣＵ、肝胆外科、血液科等，　这些病房的真菌感染率较其他病房阳性率高。　表２不同科室病原菌检出构成比　１材料和方法　１．１对象　来自２０１１年１０月至２０１２年４月北京协和医院以及　２０１２年４月至今黑龙江省医院门诊及住院患者的病原标本。　１．２试剂培养基　临床送检标本经ＥＳＰ一２５６血培养仪培养，血液或无菌　体液培养阳性培养物转种至血琼脂、沙保弱琼脂各两份分　别置于３５℃、２５℃培养箱培养２４ｈ后，对分离的真菌菌株　做乳酸酚棉蓝染色观察丝状真菌孢子特点加以鉴定。　１．３药敏试验　采用药敏试纸条法，严格按照产品说明书进行操作及结　果判读。药物包括５一氟胞嘧啶（５一Ｆｃ），两性霉素Ｂ（ＡＭＢ），　氟康唑ｆＦＥＺ），伊曲康唑ｆＩＴＲ）。　２．３　丝状真菌对抗真菌药物的敏感性分布　３５株假丝酵母菌属对４种抗真菌药物的药敏结果，其　２结果　２．１丝状真菌鉴定构成比　中两性霉素Ｂ对４种抗真菌药物全部敏感。见表３。　表３　３５例丝状真菌对抗真菌药物的敏感性分布　世界最新医学信息文摘２０１４年第１４卷第１期　注：１）ｓ代表敏感；２）ＳＤＤ代表剂量依赖性敏感；３）Ｒ　代表耐药。　２５７　３讨论　由于深部真菌感染在临床早期缺乏特征性的表现，难以　早期诊断。以烟曲霉为首的曲霉菌属依然是深部丝状真菌感　染的主要病原菌，但随着预防性抗真菌治疗的增多，很多　对临床常规用药不敏感甚至耐药的病原菌明显增加，使深　部丝状真菌感染病原菌的分布有了很大的改变，呈现出烟　曲霉所占比例逐年降低，非烟曲曲霉（如土曲霉等）以及非　曲霉丝状真菌ｆ如镰刀霉等）的感染所占比例渐渐增加的特　点口】。近来的研究显示，很多以前无致病性的非曲霉丝状真　菌，现在也能够引起导管介导的菌血症以及深部脏器的播　散性感染　］。因此，早期诊断及提供准确的药敏结果，为临　床治疗提供可靠的依据，显得尤为重要。本研究显示，临　床深部丝状真菌感染以曲霉菌为主，其它丝状真菌有上升　趋势；ＩＣＵ病房仍然是曲霉菌感染的常见科室，由于免疫抑　制剂的应用及介人技术的开展逐年增多，血液科、外科患　者深部真菌的感染率逐渐上升。目前，临床上常用的抗真　菌药主要包括氟康唑、伊曲康唑、５一氟胞嘧啶、两性霉素Ｂ、　制霉菌素等口】。本研究显示伊曲康唑及５一氟胞嘧啶的耐药　率较高，氟康唑临床敏感性下降，给临床治疗带来了困难。　另外，临床科室与微生物实验室之间缺乏沟通与信任，也导　致临床医生对病原学检测不重视，不能够合理的使用抗真　菌药物。所以应该重视病原学检测，在积极控制原发病的　同时，应当提高真菌检测水平，争取做到早期诊断和及时治　疗，并且还要根据临床实验室的体外药敏试验结果，指导临　床用药。对与那些真菌感染的高危人群，特别是在有感染症　状而常规抗菌药物治疗无效的情况下，应及时做血液、无菌　体液培养和药敏检测。　参考文献　［１］Ｎｕｃｃｉ　Ｍ，Ａｎａｉｓｓｉｅ　Ｅ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎ０ｃ０ｍｐｒ０ｍｉｓｅｄ　ｈｏｓｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００２，３５（８）：９０９－９２０．　［２】冯文莉，杨静，奚志琴，等．３年间医院内侵袭性真菌感染的病原　菌分布及临床分析ｌＪ１．中华医院感染学杂志，２００８，１８（７）：１０３０—１０３３．　［３】王文平，朱磊．深部真菌医院感染的菌群分布及耐药性分析ｆＪ１＿　中华医院感染学杂志，２００９，１９（３）：３５３—３５４．　［４］Ａｂｅｌｓｏｎ　ＪＡ，Ｍｏｏｒｅ　Ｔ，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｆｕｎｇｅｍｉａ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ　ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｏｖｅｒ　１　１　ｙｅａｒｓ　ａｔ　ａｔｅｒｔｉａｒｙ　ｃａｒｅ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，２００５，１　１６（１）：６１－６７．　［５】黄金竹，母连军．抗真菌药物的研究进展［Ｊ］．国外医药抗生素分　册，２００７，２８（６）：２４６—２５１．　（上接第２５１页）　隆抗体与淋巴细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤『和　（或）固定】等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得　到Ｔ淋巴细胞及其亚群的相对百分数。　７．２开机及仪器校准　启动之前，分别将鞘液盒和清洁液盒加满，废液桶倒净。　打开电源箱门，检查：ＡＩＲ　ＦＩＬＴＥＲ及ＶＡＣＵＵＭ　ＦＩＬＴＥＲ必须干燥无水，ＷＡＴＥＲ　ＴＲＡＰ液体不能超过１／３；　ＶＡＣＵＵＭ　ＴＲＡＰ液体不超过１／４，然后打开电源箱开关。　开启计算机，双击相应的检测图标“ＥＸＰ０３２　ＡＤＣ　ＸＬ　４　Ｃｏｌｏｒ”，启动流式细胞仪。　预热ｌ５～２０分钟，待仪器主机ＲＥＡＤＹ灯亮，即可开　始上机检测。　仪器光路与流路校准：将Ｆｌｏｗ—ｃｈｅｃｋ荧光微球校准　品室温下避光放置ｌＯ分钟，取５滴Ｆｌｏｗ　Ｃｈｅｃｋ放人洁净　１２ｍｍ×７５ｍｍ的试管，加等量蒸馏水或鞘液，混匀，选择　检测Ｆｌｏｗ　Ｃｈｅｃｋ的ＰＲＯＴＯＣＯｌ，将稀释混匀的Ｆｌｏｗ　Ｃｈｅｃｋ　试管放在样品台上进样检测，取数５０００（ＦＳ），记录前向角散　射光（Ｆｓ）及荧光ＦＬ１一ＦＩＡ的ＨＰＣＶ值，核对是否＜２％。　仪器光路与流路校准合格后才能进行样本检测。　５仪器　流式细胞仪ＥＰＩＣＳ　ＸＬ（美国Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏ　ｇｔｅｒ公司）。　６试剂　单克隆抗体Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏ　ｇｔｅｒ公司的ＣＤ４５一ＦＩＴＣ／　ＣＤ４一ＲＤ１／ＣＤ８一ＥＣＤ／ＣＤ３一ＰＣ５，　或ＣＤ４一ＦＩＴＣ／ＣＤ８一ＰＥ／　ＣＤ３一ＰＣ５。　Ｂｅｃｋｍａｎ　ＣｏＩＸ　ｇｔｅｒ公司的ＯｐｔｉＬｙｓｅ　Ｃ（溶血素）。　ｃＬＥＮｚ（ｃｌｅａｎｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ，清洗液）。　Ｉｓｏｔｏｎ　ＩＩＩ　Ｄｉｌｕｅｎｔ（稀释液或磷酸盐缓冲液或鞘液）。　Ｆｌｏｗ—ｃｈｅｃｋ荧光微球校准品。　７操作步骤　７．１标本荧光染色　７．１．１全血标本前处理　取１００ＩＸｌ抗凝全血或１０６个细胞／ｍｌ加入标号的　７．３标本上机检测　７－３．１　建立分析方案（Ｐｒｏｔｏｃｏ１）　１２ｍｍ×７５ｍｍ试管中，加入ｌ０　ｌ荧光素标记的单克隆抗体　混合试剂ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８或ＣＤ４５／ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８，混匀，室　温避光孵育２Ｏ分钟；加入５００ＩＸ　ｇ溶血素，混匀，室温避　光孵育ｌＯ分钟；加人５００　ｇ稀释液，混匀，室温避光孵育　１０分钟；２小时内上机检测。　７．１．２肺泡灌洗液前处理　取５　ｌＯｍｌ肺泡灌洗液，用双层洁净纱布过滤于　标号的１５ｍｌ离心管中，５００ｇ离心５分钟，弃上清（残留　沉淀物２００　１左右）。混匀沉淀，取１００／Ｉｆ加入标号的　ｌ２ｒａｍ×７５ｍｍ试管中，加入ｌ０　ｌ荧光素标记的单克隆抗　体混合试剂ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８，混匀，室温避光孵育２０分钟；　加入３００　ｌ溶血素，混匀，室温避光孵育１０分钟；加入　３００　１稀释液，混匀，室温避光孵育１０分钟，５００ｇ离心５　分钟，弃上清，加入５００　ｌ稀释液，混匀，２小时内上机　检测［２１。　选择相应的参数并画图，依次将同型对照管以及单阳性　管ｆ前处理同样本管）上机并调整合适的增益、电压和颜色　补偿，保存该方案。方案建立好后，只要仪器状态及标本　条件不变，即可一直使用该分析方案。　７－３．２选择相应的分析方案（Ｐｒｏｔｏｃｏ１）　将前处理好的标本管放在样品台上进样检测，调整门的　大小。待仪器停止收集后，对结果进行分析和记录。　７．４清洗仪器　关机前需要执行仪器日常清洗程序和真空管清洗程序。　参考文献　［１］赵衍江．恶性肿瘤患者外周血Ｔ淋巴细胞ＣＤ２５的测定与临床检　验学研究『Ｊ】．中国当代医药，２０１２，１９（３２）：９９—１００．　［２】王世婷，姚伯程．实用ＭｃＡｂ—Ａ—Ｅ直接法检验Ｔ淋巴细胞亚群反　应管替代对比研究［Ｊ］．中国保健营养（中旬刊），２０１２，１０：２６—　２７．