一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化
2021-12-07
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福建农林大学学报(自然科学版) 第4o卷第1期 Journal of Fujian Agriculture and Foreta ̄University(Natural Science Edition) 2011年1月 一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化 袁科平 ,邹世平 ,李谷 ,何力 ,周群兰 (1.农业部淡水生物多样性保护与利用重点开放实验室/中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北 荆州434000;2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,江苏无锡214081;3.热带亚热带鱼类 选育与养殖重点开放实验室/中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东广州510000) 摘要:从水产养殖环境中分离、筛选得到一株菌CJ00l,经菌落形态特征、生理生化特征及16S rDNA测序,鉴定其为地衣芽 孢杆菌.地衣芽孢杆菌可有效降低养殖水体中的化学需氧量(COD),48 h内COD的降解率达86.8%,水温30℃时的降解 率最高,达到85.7%.为优化培养基组成,选出由单因素试验确定的营养物质(红糖、玉米粉、豆粕、尿素)和NaH ̄PO,,进行 5因素4水平的正交试验.结果表明,CJO01菌株的最佳培养基配方为:红糖3%、玉米粉l%、豆粕3%、尿素0.25%、 NaH2PO,0.15%,其活菌数可达11.15 X109 du-mL~. 关键词:地衣芽孢杆菌;水产养殖;化学需氧量;培养基优化;正交试验 中图分类号:Q939.124 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2011)01-0069-05 Identiifcation of all aquatic BacH/us licheniformis CJ001 YUAN Ke.ping ・ ,ZOU Shi.ping ,LI Gu ,HE Li ,ZHOU Qun.1an (1.Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation and Utilization,Ministry 0f Agricultu ̄Yanstze River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Jingzhon,Huhei 434000,China;2.Freshwater Fisherise Reses ̄ Center,Chinese Academy 0f Fishery Sciences,Wuxi,Jiangsu 214081,China;3.Key Laboratory Tropical&Subtropical Fish Breeding&Culitvation of Chinese Academy ofFishery Sciences,Guangzhou,Guansdong 510000,China) Abstract:Strain cJ001 w砸isolated and selected from sediment samples ofbreed aquatics pond in Wuhan.Based on its major mor- phologic。physiology・biochemistry characteristics and 16S rDNA sequence analysis,strain cJ001惴identiifed a8 Bacillus lichen1- fo.niJ.The strain could degrade the chemical oxygen demand(COD)in aquacultural water effectively,especially at the time 0f48 h(wiht 86.8%de ada 0n rate)or underthe etmperature of30℃(witlI 85.7%degradation rate).AccordingtOthe resluts 0f sin- fie-factor orthogonal tset for culture optimization,the orthogonal experimem iwth 5 factors(brown sugar,col powder,bean,car- bamide and NaH,PO4)and4 levels w船then carried out.The optimal Inedlm W舾as follows!brown sugar3%,corn powder 1%, bean 3%,carbamide0.25%andNail2PO40.15%,re8pectively.Underthe condition 11.15 Xlo,c bacteira permilliliterwere obtained. Key words:Bac/// ̄licheniformis;aquaculture;chemical oxygen demand;media optimization;orthogonal experiment 近年来,养殖水域环境不断恶化,水体富营养化、水生动物病害等问题困扰着水产养殖业的进一步发 展….传统的抗生素防治法虽然能较好地控制病害,但抗生素的大量使用不仅会使细菌耐药性增强,破坏 和干扰养殖环境的正常生物区系,导致养殖水体中微生物的生态失调,且产生的二重污染会在生物体内残 留,严重影响水产品的品质 . 微生态制剂可以有效分解有机物、抑制病原菌生长繁殖、调节水体环境生态平衡,同时不会造成药物 残留及抗药性问题,因此在水生动物健康养殖中的应用日渐广泛 】.芽孢杆菌(Bacillus toyoi)微生态制剂 具有稳定性好、耐挤压、耐高温等优点,在动物肠道能产生多种消化酶及氨基酸等营养物质,有广阔的应用 前景.Kozasa【4 首次从土壤中分离出1株芽孢杆菌添加到日本鳗鲡饵料中,降低了鱼体因感染爱德华氏菌 的死亡率.地衣芽孢杆菌(Bacillus Z 饥 丌旆)是我国20世纪9o年代起开发利用的新型微生态制剂,在 收稿日期:2010—04—12 修回日期:0210—06—24 基金项目:中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目(2oo7-oo8);热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室开放课题. 作者筒介:裹科平(1980一),男,助理研究员。硬士.研究方向:水环境生态修复. ・7O・ 福建农林大学学报(自然科学版) 第40卷 水产养殖业已得到应用.前人[5I7 研究表明,在鱼饲料中添加地衣芽孢杆菌,可提高鱼体的酶活性,促进生 长,提高成活率.谢航等 研究表明,地衣芽孢杆菌能有效降解水体残余饵料的蛋白和淀粉. 地衣芽孢杆菌在水质净化方面的作用鲜有报道.本试验在水产养殖环境中筛选到一株具有降解有机 质功能的地衣芽孢杆菌,以化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)为指标,观察其净化水质的作用, 并通过单因素和正交试验初步优化了发酵培养基,旨在为该菌的实际应用和新型微生态制剂的研发提供 理论依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1样品来源供试样品采自湖北省武汉市多个养殖池塘的底泥. 1.1.2培养基液体种子培养基:含5 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaC1,定容至1 L,pH 7.0,于0.1 MPa灭 菌20 min.固体种子培养基则在上述培养基中添加2%琼脂. 初始发酵培养基:含3O g葡萄糖、20 g(NH4)2SO4、0.5 g MgSO4、1 g NaH2PO4,定容至1 L,pH 7.0,于 0.1 MPa灭菌50 arin.培养基优化时按试验设计方案调整各组成成分. 1.2菌株的分离与筛选 用污泥采样器取水产养殖池塘投饲处表层淤泥.称取不同池塘采集的样品1 g,悬浮于100 mL无菌生 理盐水,摇匀,于80℃水浴10 min,从中取l mL进行梯度稀释,分别涂布于固体种子培养基平板上,于37 cI=恒温箱倒置培养48 h.挑选生长快速、直径较大的菌落,进行芽胞染色和革兰氏染色,镜检观测是否有芽 胞产生,初筛出50株芽孢杆菌. 将初筛得到的菌株分别接种在初始发酵培养液中,在37℃培养24 h后,于6OOO r・rain 离心5 min, 倒掉上清液.用生理盐水将试验菌株配成菌量为1×10。cfu・mL 的茵悬液,取0.1 mL菌悬液加入约l L 的试验水样,使水体最终的含菌量为l×10‘efu・mL~,同时测定其降解水体COD、饲料残渣的能力 】,每 隔24 h测定一次,连续5 d.通过比较,筛选出一株降解效果最佳的菌株,命名为CJ001. 1.3菌株的鉴定 1.3.1形态和生理生化鉴定采用牛肉膏蛋白胨培养基固体平板划线法,于37℃培养48 h后,观察菌落 的形态,并挑取少量菌体采用光学显微镜进行革兰氏染色观察和芽胞染色观察.生理生化鉴定参照《伯杰 细菌鉴定手册》[1 和《常见细菌系统鉴定手册》¨u进行. 1.3.2 16S rDNA序列鉴定TACGACrrI'一3,[13]. 采用SDS碱裂解法【】 】提取细菌总DNA,采用细菌16S rDNA通用引物进行 PCR扩增,其引物序列如下.P16 sF1:5 一AGAGTIq'GATCMTGGCTCAG一3 ;P16 sB1:5 一GGCTACCTrGT- PCR反应条件:96℃预变性5 min;96℃变性1 min,56 cI:复性1 min,72 oC延伸2 arin,30个循环后于 72℃延伸10 arin,4 oC保温.PCR产物经纯化回收后送上海生工生物工程技术服务公司进行测序.将所测 得的序列与GenB ̄ak中的16S rDNA序列进行Blast相似性分析比较,以16S rDNA基因序列同源性>99% 为鉴定标准【l引. 1.4菌株Cj加O1在养殖水体应用效果的测定 从湖北省某鱼塘取得一养鱼水体,按l×10 cfu・mL 的添加量添加菌种到COD为100 mg・L 的1 L水体中,在室温(25 oC)条件下震荡培养144 h,每隔24 h取样测定水体COD;另取菌种按1×10 efu・ mL 的添加量添加到1 L水体中,在不同温度(1O、2O、3O、40、5O cI=)下培养,均于24 h后监测水体中COD 的变化,以研究时间和温度对菌株CJ001降解水体中有机质的影响,同时做3个平行试验,取平均值.COD 降解率采用重铬酸钾法¨副测定,COD降解率/%=(CODm理前一CODm ̄)/COD ̄mm×100. 1.5培养基的优化 取活化好的斜面菌种,用接种环挑3环接种到盛有50 mL无菌种子培养液的500 mL三角瓶中,于 37 ̄C震荡(转速180 r・min )培养24 h.将上述种子培养液按10%的接种量接种到盛有50 mL发酵培养 第1期 袁科平等:一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化 ・7l・ 基的500 mL三角瓶中,37℃震荡(转速180 r・min )培养24 h.24 h后取样,采用平板稀释法进行活菌 计数【】引.以初始发酵培养基为基础,通过分别改变不同的碳源(葡萄糖、乳糖、红糖、玉米粉、大米粉、红薯 淀粉)或氮源[尿素、(NH.):SO.、NaNO,、蛋白胨、牛肉膏、豆粕],进行单因子试验,确定培养基中适宜的碳 源和氮源.根据单因素优化试验结果,选出利于活性物质产生的4种营养物质(红糖、玉米粉、豆粕、尿素) 和1种无机化合物(NaH:P )共5个因素,设置4个水平,进行正交试验,并对结果进行直观分析和方差 分析,优化培养基. 2结果与分析 2.1菌株的鉴定 2.1.1形态特征菌落为白色,不透明,表面较平且干燥,边缘光滑.菌体呈直杆状,长1.5—3.0 ttm,宽 0.6-0.8 Izm.革兰氏反应呈阳性. 2.1.2生理生化特征生理生化鉴定结果见表1.根据菌株CJ001的生理生化特征,参照《伯杰细菌鉴定 手册》【1。】初步鉴定菌株为芽孢杆菌菌属. 衰l CJ001菌株主要生理生化特征 I Table 1 The major pl l0留-b.a出咖Iighy characteristics d strain CJ001 试验项目结果 试验项目结果 试验项目结果 硝酸盐还原 + 甲基红试验 + 明胶试验 + 柠糠酸盐 + V-P试验 + 卵磷脂试验 一 亚硝酸盐 + 吲哚试验 + 葡萄糖 发酵型 淀粉水解 + 过氧化氢酶 + 石蕊牛乳试验 产酸凝固 ”+表示阳性,一表示阴性. 2.1.3 16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析结果 以PI6 sF1和PI6 sB1为引物,菌株C】o0l总DNA 为模板进行PCR扩增.优化缓冲体系、镁离子浓度和模板DNA的稀释倍数,可以扩增出约1500 bp的特异 条带.从琼脂糖凝胶上切割特异性的1500 bp的条带,用试剂盒回收纯化PCR产物,送上海生工生物工程 技术服务有限公司进行DNA序列的测定.将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行Blast相似 性分析比较,菌株CJ001与地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列的同源性达到了99%. 根据16S rDNA序列分析结果,综合考虑菌株的细胞壁革兰氏染色、菌落形态特征、生理生化特征,鉴 定菌株CJo01为地衣芽孢杆菌. 2.2菌株在养殖水体中的应用 2.2.1处理时间对菌株CJ001降解COD的影响室温条件下处理时间对菌株CJ001降解COD的影响见 图1.从图1可以看出,48 h时,COD从100 nag・L-1下降到13.12 mg・L~,菌株CJ001对水体中有机质的 降解率达86.8%. 2.2.2温度对菌株CJ001降解COD的影响温度是水产养殖的重要指标之一.不同温度(1O、2o、3O、40、 50℃)下菌株CJo01对COD的降解效果见图2.从图2可以看出:温度较低时,水样COD的变化并不显 著;20℃时,COD的降解率为72.4%;30℃时,COD的降解效果最好,降解率达到85.7%;当温度进一步升 高至50℃时,降解率仍可达到80.1%.可见,菌株C脚l的温度适应性广泛,可以适应20—5O℃的环境, 显示了极强的应用前景. 2.3培养基优化 2.3.1 单因素优化试验本试验研究了葡萄糖、乳糖、红糖、玉米粉、大米粉和红薯淀粉作为碳源对活菌 数量的影响.结果表睨,红糖和玉米粉做碳源的活菌数高于其他的碳源(数据未列出).以尿素、 (NH.):SO NaNO,、蛋白胨、牛肉膏和豆粕为氮源的结果表明,牛肉膏和蛋白胨等有机氮富含各种氨基酸 和微量元素,对菌体生长有较大的促进作用,豆粕和尿素的效果次之(数据未列出).综合考虑成本,以价 廉易得的豆粕和尿素作为适宜氮源.因此将红糖、玉米粉、豆粕和尿素这4种营养因素作为正交试验研究 的对象. ・72・ 1oo 福建农林大学学报(自然科学版) l00 第40卷 80 80 \爵 60 餮 盘 o 40 0 U 60 譬 世 8 4o U 20 20 O O 24 48 72 96 120 144 lO 2O 3O 40 5O 时间/h 温度/℃ 图1处理时间对C.J001菌株降解COD的影响 Fig.1 Effect oftime Oil COD degradation by 8tl ̄n cJ00l 图2温度对CJ001菌株降解COD的影响 Fig.2 Effect 0ftemperature on COD degradation by 811 ̄irl CJ001 2。3.2 正交优化试验 根据单因素优化试验结果,选出红糖、玉米粉、豆粕、尿素以及无机化合物 NaH:PO。,进行5因素4水平的正交试验,优化培养基组成(表2).对结果进行直观分析和方差分析可知, 5种因素对地衣芽孢杆菌发酵液菌数影响的显著性大小为:红糖>玉米粉>豆粕>尿素>NaH:Po。.培养 基的最佳配比为:红糖3%、玉米粉1%、豆粕3%、尿素0.25%、NaH2PO。0.15%.接种量在10%的情况下, 采用该配比的发酵培养基于37℃下培养24 h后,其活菌数可达l1.15×10 cfu・mL~. 表2正交试验结果 Table2 Results 0fthe orthogonal experiment 3讨论 COD是衡量水体中有机物总量的重要因子l】 .对养殖生产来说,有机物质含量的高低对水体的水质 及生物有多方面影响.有机物在水中的积累超过一定的限度时,会使养殖水体呈富营养型,溶氧、pH等水 质条件恶化,引起鱼虾大批死亡. 微生态制剂可利用有益微生物菌群的生理生化作用,分解、合成或转化水中的有害物质,从而调节和 净化水质.据报道,芽孢杆菌微生态制剂在水产应用方面具有良好的脱氮去磷的活性¨ 】,在养殖过程中 施用芽孢杆菌可有效降低水体中COD、硝酸盐和亚硝酸盐的含量啪J,促进养殖水体中的生态良性循环.本 第1期 袁科平等:一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化 ・73・ 试验主要从降解有机物方面观察了菌株CJ00l净化水质的作用,并通过单因素和正交试验初步优化了发 酵培养基,为工业化生产奠定基础.本试验结果表明,菌株CJool可有效降低养殖水体的COD,处理48 h 及水温在30℃时的降解效果较好.曹煜成等 认为,定期施用地衣芽孢杆菌有利于养殖水体形成良好的 透明度及水色,促进养殖生物的健康生长,这与本试验的结果相似. 芽孢杆菌不是养殖水体的优势菌群,在实际生产中可以通过定期或不定期地使用高密度的高效菌液, 使其在养殖水体中形成优势菌群,进而改善水体中的微生态结构,为养殖生物营造一个良好的水生环境. 4结语 从水产养殖环境中分离、筛选得到一株可净化水质的菌株CJo01,经菌落形态特征、生理生化特征及 16S rDNA测序,鉴定其为地衣芽孢杆菌.菌株CJ0o1可有效降低养殖水体中的COD,48 h内对养殖水体 COD的降解率达86.8%;水体温度为30℃时,COD的降解率最高,达到85.7%.优化培养基的最佳配比 为:红糖3%、玉米粉l%、豆粕3%、尿素0.25%、NaH2PO4 0.15%,其活菌数可达l1.15×10 cfu・mL~. 参考文献 [1]单志欣.养殖水质分析与控制(三)化学需氧量[J].齐鲁渔业,2OO0,17(1):38. 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