高效液相色谱法测定毛竹种子萌发过程中GA_3含量的变化

[DOI]CNKI：34-1162/S.20110624.1625.018 网络出版时间：2011-06-24 16:25:01 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20110624.1625.018.html

高效液相色谱法测定毛竹种子萌发过程中GA3含量的变化

梁晓静1, 2，高 健1*，徐有明2

(1. 国际竹藤网络中心，国家林业局竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102；2. 华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070)

摘 要：通过优化预处理和检测方法，采用Waters C18反相色谱柱，以磷酸缓冲盐和乙腈为流动相，外标法测

定 GA3的回收率为78.42%，变异系数±3.9，保留时间稳定，首次建立了毛竹种子中植物内源激素GA3含量的测

结果表明，从浸种到出苗时GA3的含量在2.56~14.75 定方法。运用此法测定毛竹种子萌发过程中GA3含量的变化，

µg·g-1，吸胀阶段含量变化不明显，而浸种36 h后含量大幅升高，在72 h和即将萌出胚根时达到峰值，随着毛竹种子的萌发进程，GA3含量呈总体上升趋势。

关键词：高效液相色谱；毛竹种子；萌发；GA3

中图分类号：S795 文献标识码：A 文章编号：1672−352X (2011)04−0496−04

Determination of GA3 content in moso bamboo seed during germination by HPLC

LIANG Xiao-jing1, 2, GAO Jian1, XU You-ming2

(1. Key Laboratory of Science and Technology, International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102; 2. College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070)

Abstract: The measurement of endogenous GA3 contents in moso bamboo seed was set up for the first time by optimizing pretreatment and determination method, which was carried out with external standard method on a reverse phase Waters C18 column using phosphoric acid buffer and acetonitrile as mobile phase. The results showed that recovery rate was 78.42%, the RSD was ± 0.039, and retention time was stable. Changes within the germination of the moso bamboo seed in the content of gibberellins were studied during sprouting. GA3 level in-creased from 2.56 µg·g-1 to 14.75 µg·g-1 during sprouting process. GA3 levels were low at the beginning of the soaking, and then increased greatly after 36 h after soaking to the highest peak at 72 h until radicle appeared. The levels of GA3 were higher in radicle than that in embryo.

Key words: HPLC (high performance liquid chromatography); moso bamboo seed; germination; GA3

赤霉素最早从水稻恶苗病菌的发酵滤液中分离（RIA）和酶联免疫法（ELISA），放射免疫法（RIA）出来，发现这种物质能够促进水稻的徒长，被命名具有较高的灵敏度，可以检测出nmol或pmol的微

赤霉素大多存在为赤霉素(gibberellin，简称GA)[1]。量物质[3-4]，但需要放射性同位素，由于放射性同位

于高等植物中，影响着高等植物生活史的各个阶段, 素的不稳定性及对操作者身体的损伤，RIA法现在如种子的发芽、茎秆的伸长、叶片的延展、表皮毛已较少使用。酶联免疫法（ELISA）是用某些酶对状体的发育、开花时间及花与果实的成熟等[2]。目免疫原进行标记，避免了使用放射性物质，但测定前所知，赤霉素是一大类植物激素，其中GA3最为结果重复性差，这些局限导致其在植物激素的定性普遍和重要。 定量研究中未能得到广泛的应用。GC法较HPLC

植物内源赤霉素的测定方法主要有免疫分析法灵敏度高，但在测定除乙烯以外的激素需要经过法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）衍生化处理生成易挥发的衍生物才能进行分析，衍和色谱-质谱联用法等。免疫分析法有放射免疫法生化过程繁琐，而HPLC法与之相比，大大简化了

收稿日期: 2011-03-18

基金项目: 国家“十一五”科技支撑项目(2006BAD19B0203)资助。 作者简介: 梁晓静，女，硕士。E-mail：Xj-xj-xj@163.com

* 通讯作者: 高 健，女，研究员，博士生导师。E-mail：gaojian@icbr.ac.cn 38卷4期

梁晓静等: 高效液相色谱法测定毛竹种子萌发过程中GA3含量的变化 497 样品的前处理过程。色谱-质谱联用法是测定植物内源激素最准确可靠的方法，但其样品净化过程复杂，设备昂贵，使用和维护成本相对较高。

高效液相色谱法（HPLC）已在很多植物激素的分析中得到应用，90年代末朱智甲等[5]利用高效液相色谱测定了小麦幼苗中GA3的含量，得到小麦幼苗中GA3的含量为8.14 µg·g-1和12.28 µg·g-1。 2002年，王若仲等[6]建立了PVPP柱、DEAE柱、Sep-pak柱联用的快速净化提取植物内源激素的方法，并测定了杂交稻的4种内源激素，其中GA3得到很好的分离。郑郁善等[7]应用高效液相色谱仪对毛竹笋期的竹叶、竹秆、竹鞭和当年正常生长的竹笋中GA3的含量及其分布规律进行了研究，杨彤于等[8]对利用高效液相色谱法测定毛竹竹笋中GA3的可靠性进行了研究，但该提取流程用于毛竹种子GA3的提取分离效果不佳。本研究在前人方法的基础上，对样品提取方法、吸收波长、流动相选择等环节进行改良，旨在更准确的测定出毛竹种子萌发过程中的GA3含量。近来，已有竹类育种工作者开展利用外源GA3提高毛竹种子活力的研究，适当浓度外源GA3处理毛竹种子可以促进种子萌发，提高种子活力。但还没有关于毛竹种子萌发过程中内源GA3含量变化及变化机理的报道。本试验利用高效液相色谱法就毛竹种子萌发过程中GA3含量的动态变化进行研究，旨在为阐明GA3在毛竹种子萌发过程中的作用和毛竹实生苗培育过程中外源激素的应用提供理论依据，也为进一步开展毛竹种子萌发过程中GA3代谢与调控研究奠定基础。

1.3 标准品的配制

用乙腈定容到100 准确称取GA3标准品0.01 g，

mL棕色容量瓶中，作为母液（100 mg·L-1），然后再分别稀释为20、10、5、2和1 mg·L-1浓度。 1.4 样品的制备

参照张政等[11-13]的提取、分离和纯化方法，按如下方法制备样品：准确称冻干样品，用德国制造的Retsch混合球磨仪MM301将样品磨成粉末，加入预冷的乙腈，超声波震荡30 min，放置4℃冰箱过夜，浸提液以5 000 r·min-1离心15 min，分离上清液，残渣中分别再加入8 mL和4 mL的乙腈，超声波震荡0.5 h重复浸提2次，合并3次所得的上清液，全部滤液在35℃浓缩蒸干，分3次用pH8的磷酸缓冲液冲洗蒸馏瓶，然后加入等体积石油醚萃取脱色3次，弃去酯相后，滤液用2 mol·L-1的柠檬酸调pH至2.5~2.8，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，于35℃减压浓缩至干，然后加pH3的磷酸缓冲液复溶，过Sep-pak C18预处理小柱，小柱使用前先用5 mL甲醇活化，再用5 mL超纯水平衡柱子，样品过柱后用5 mL超纯水清洗，最后用2 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，溶液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。 1.5 色谱条件

Waters C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：35℃；流动相：乙腈(CH3CN) ∶水(4∶6 V/V)；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 µL；检测波长：210 nm；采用外标法定量。

2 结果与分析

2.1 流动相的确定

测定赤霉素的流动相因为色谱柱的不同而有很大的差别，常用的流动相有甲醇-水[14]，乙腈-水[15]，甲醇-乙腈-水[16]，水中常含有少量的酸，可以抑制样品的电离，改善拖尾现象。经过多次实验比较，

其中水采用流动相为乙腈(CH3CN)∶水(4∶6 V/V)，

中含有0.1%的磷酸，出峰效果最好，可以分离GA3。

2.2 波长的选择

GA3在远紫外区域（200 nm附近）接近其最大吸收波长，一些研究为了避免与溶剂峰重叠，将GA3的检测波长设定为254 nm[17-18]。但此波长下，GA3的吸收降低造成GA3的检测灵敏度下降[19]。本试验中，GA3在254 nm下的吸收峰很小，而在210 nm下的吸收峰达到最大，并且没有溶剂峰出现。所以选择210 nm为GA3的检测波长，如图1所示。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试种子采自广西桂林，采后通风干燥，含水量约为11%，剥壳后于4℃冰箱中用塑料袋封存。参照蔡春菊和李伟成等[9-10]的方法进行浸种处理。

取样：种子浸种12 h后开始取样，装入锡纸袋，放入液氮中速冻后于－80℃冰箱冷冻保存，以后每隔12 h取1次样，直至露白，待胚根、胚芽长度与种子等长取胚根、胚芽样品，以干种子作为对照。 1.2 仪器和试剂

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，KQ5200E型超声波清洗器，赤霉素（GA3）标样为美国Sigma产品，纯度≥98.5%，乙

、甲醇（CH3OH）为色谱纯，其他试腈（CH3CN）

剂均为分析纯，水为超纯水。

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安 徽 农 业 大 学 学 报 2011年

图 1 GA3标准品色谱图

Figure 1 Chromatogram of standard GA3

2.3 标准曲线绘制

外标法进行峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，如图2所示。

的回收率为78.42%，变异系数±3.9。 2.5 内源GA3的定性分析

按保留时间确定GA3采用上述方法对毛竹种子内源GA3进行测定，样品内源GA3色谱峰图如图3。 2.6 内源GA3的定量分析

根据测得GA3峰面积值和上述回归方程计算得到GA3的浓度，得到GA3的质量比上所称取种子的质量即得到种子中GA3的含量。毛竹种子不同萌发阶段GA3的含量的变化如图4所示。随着萌发过程内源GA3的含量整体上表现出升高的趋势，其中，吸胀阶段GA3含量变化不明显，干种子与浸泡12 h后种子中GA3的含量变化保持在2.56~2.92 µg·g-1, 萌发36 h后，GA3开始大幅度升高，并在72 h达到第1个峰值，为14.45 µg·g-1，是干种子的5.64倍。在胚根中达到第2个峰值，为14.75 µg·g-1，是干种子的5.76倍，胚芽内GA3含量比胚根内略有降低。

图 2 GA3的标准曲线

Figure 2 Standard curve of content of GA3

GA3的标准曲线线性方程为y=17942x-1507.2，R2=0.9999，线性关系良好，符合分析要求。

图 4 毛竹种子萌发阶段GA3含量变化

Figure 4 GA3 content during bamboo seed germination

3 小结与讨论

建立了毛竹种子内源激素测定的HPLC方法，GA3的回收率为78.42%，变异系数±3.9，且保留时间稳定，重现性好，符合定量分析要求。

获得了毛竹种子萌发过程中内源GA3的变化规律。在毛竹种子萌发过程中，赤霉素的含量在2.56~14.75 µg·g-1，呈上升趋势。在胚根即将伸出时

可能是较高的和浸种72 h时GA3的含量达到峰值。

从而有利于胚根伸出[21]。 GA3促进胚乳细胞壁降解，

GA3是一种特殊的植物次生代谢产物，在植物体内的含量非常低，且化学性质不稳定，容易氧化、易受其他组分干扰，因此有必要建立和优化GA3的提取和纯化流程。溶剂提取法是目前最常用的植物激素提取方法[22]，甲醇、乙腈、丙酮及其水溶液和中性、酸性缓冲溶液是常用的提取液，本试验比较

图 3 毛竹种子样品内源GA3色谱图

Figure 3 Chromatogram of endogenous GA3 in seed of moso

bamboo

2.4 回收率的计算

采用添加标样法测定回收率，用添加标样的激素峰面积减去未加标样的样品的相应峰面积, 所得的差值与相应激素标样的峰面积之比（百分比）为回收率。将干种子样品分为2份，其中一份加入已

另一份不加标样计算本底值，GA3知量的GA3标样，

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梁晓静等: 高效液相色谱法测定毛竹种子萌发过程中GA3含量的变化 499 了甲醇和乙腈提取效果，结果表明乙腈提取GA3得到的回收率高于甲醇。在提取的过程中应注意避免光照和高温环境，本试验在提取剂乙腈中加入BHT以保持GA3在提取过程中的稳定。采用超声波震荡提取可以提高提取效率，缩短提取时间，防止可能的分解作用。在纯化GA3时采用溶剂萃取法和固相萃取法相结合的方法，虽然不少研究者采用PVPP来吸附色素和酚类物质，起到进一步除杂的效果，但PVPP在除杂的过程中也会带走一部分激素，本试验发现加入PVPP，使提取过程更加繁琐，提取时间延长，色谱检测时，GA3的含量较低，因此本试验中不加PVPP。为了有效去除对目的物峰型有较大干扰的GA3类似物、色素、酚类和有机酸等，

所采用多次萃取与Sep-pak C18预处理小柱分离法，

得回收率稳定在78%左右，效果比使用PVPP好。

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