柠檬酸三钠法制备胶体金及其应用

Sum291No.12

学工程师Engineer20192019年第年第1212期期Chemical科

研与开发

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20191212

崔向红，黄国庆，王曹涤非，薛佳莹，雷

黑龙江哈尔滨150020）（黑龙江省科学院高技术研究院，

摘并确定了CA153抗体包被胶体金的最适条件，要：本文研究了柠檬酸三钠法制备胶体金的最适条件，

胶体金最适制备条件为1%柠檬酸三钠加入量为制备出稳定的CA153抗体包被的胶体金。实验结果显示，

（HAuCl4）16mL·L-10.01%氯金酸，沸腾时间为10min。免疫金的最适制备条件是pH值为9.0，CA153抗体线性度高。加入量25.0滋g·mL-1。上述条件制备的免疫金稳定性好，

关键词：胶体金；柠檬酸三钠；CA153中图分类号：O69

文献标识码：A

Preparationandapplicationofcolloidalgoldbytrisodiumcitrate*

（InstituteofAdvancedTechnology,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin150020,China）

CAODi-fei,XUEJia-ying,CUIXiang-hong,HUANGGuo-qing,WANGLei

condition.TheoptimummethodforcoatingcolloidalgoldwithCA153antibodyisdeterminedtopreparestableim原munogoldpreparedundertheaboveconditionhasgoodstabilityandhighlinearity.

Keywords:colloidalgold；sodiumcitrate；CA153

Abstract:Themethodofpreparingcolloidalgoldbysodiumcitrateisstudiedfordefinitionofthereaction

munogold.Theresultshowedthattheadditionamountof1%SodiumCitrateis16ml·L-1HAuCl4.Theoptimumval原ueofpHis9.0forpreparationofimmunogold.TheadditionamountofCA153antibodyis25.0滋g·mL-1.Theim原

胶体金（colloidalgold）也称金溶胶，是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒大小多在1耀100nm之间，能够稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在胶体金溶液中[1]。胶体金具有胶体的多种特性，对电解质敏感，易被破坏水化层，凝聚成大颗粒形成沉淀等。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金，加强其稳定性的作用[2]。利用胶体金与蛋白质的结合形成的溶液叫免疫金复合物，主要应用在免疫反应中检测抗原或抗体[3,4]。

胶体金的制备方法有很多，多采用还原法。氯常用还原剂有鞣金酸（HAuCl4）是主要还原材料，

硼氢化钠等[5]。制备出的粒径酸、抗坏血酸、白磷、较大，多在1~20nm之间，与蛋白结合形成免疫金

后，在抗原或抗体检测中易出现稳定性差的现象。用其制备胶体柠檬酸三钠是工业中常用的稳定剂，

金可增强其稳定性，因此本文将用柠檬酸三钠法制

备胶体金，并对胶体金的应用进行检测。CA153是

收稿日期：2019-09-06（ZNJZ2017GJS01）基金项目：黑龙江省院所基本应用技术研究专项（1981-）研究方向：肿瘤分子生作者简介：曹涤非，女，副研究员，博士，物学。乳腺癌重要的标志物之一，它与乳腺癌的诊断和预后有重要的关系[6,7]。本研究将CA153抗体包被在胶体金颗粒上，并对其稳定性进行检测。研究建立的方法为胶体金临床检测应用奠定基础。

1

1.1

实验部分

材料与试剂

硝酸纤维素抗体（爱必信上海生物科技有限公司）；

膜，酪蛋白，PVP-10，海藻糖（北京博奥拓达科技有津瑞金特化学品有限公司）；H3BO3（天津市恒兴化

；学试剂制造有限公司）蔗糖（西陇化工股份有限公司）。

；限公司）Tris-base，BSA（德国BioFrox）；EDTA（天

氯金酸（HAuCl4），柠檬酸三钠（Sigma-；ALDRICH）；CA153标准品（Abnova公司）CA153

1.2

HDM-500磁力搅拌加热套（金坛市杰瑞尔电

；器有限公司）H-2050R离心机（湖南湘仪实验仪器

实验仪器

；（北京普析开发有限公司）T6紫外可见分光光度计

，通用仪器有限责任公司）GFL-45恒温鼓风干燥箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）。

2019年第12期曹涤非等：柠檬酸三钠法制备胶体金及其应用*

13

圆1.3.1

1.3实验底烧瓶柠檬方法

中加入酸三100mL钠最适0.01加入豫量的HAuCl确定在500mL

搅拌加热套上回流加热至沸腾，

4溶液，在磁力快速搅拌下分别迅速加入1豫柠檬酸三钠溶液1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL

待溶液颜色变红，继续加热10min，自然冷却至室

温，4益保存备用。在波长400~700nm范围内进行全1.3.2

波长扫描金酸溶液最佳，100ml反记录应吸收峰变化。于时三间口的烧确瓶定

中，分磁别力搅拌取0.01%加热的至氯

沸

腾，加入1.6mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅2mL拌加热回流，分别在6，8，10，12，1.3.3

。检K2CO3溶液免疫测各，金样品的最大吸光度值。14min取样

将制同备一最批适次pH还原值确的胶定

体金用溶液0.1mol分别·L-1

调

至pH6.0，7.0，8.0，9.0，10.0。各取200滋L至1.5mL

离心管中，分别加入4滋gCA153抗体，混匀后室温

反应10min，各管中加入40滋L浓度为10%的NaCl

水溶液，静置2h。观察各管中溶液颜色及沉淀变化，确批1.3.4

定最适免疫pH金值最。次还原的胶体金适溶液标记调抗至体最浓适度pH的值确，

定各取将200同滋一

L加入CA153离心管中，分别加入2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的管40滋L浓抗度体为，10%混匀的后室NaCl温反水应溶液10min，静。置各2h管，中观察加入

各

1.3.5中溶液至免疫颜色金及的沉淀制备变化按，最确适定条件最适制抗备体胶加入体金量。

，

调10minpH值为9.0，加入CA153单抗，混匀，室温反应匀，静置后10min，加入。10%13000rBSA·min水-1，离溶液心15min100滋，L吸。漩涡弃上清震荡液，混

沉

淀物用硼酸盐缓冲液重悬至原体积。13000r·min-1，离心15min，吸弃上清液。用免疫金稀释液将沉淀稀释至1.3.6

原体积在免疫的金1/5稳，4定益性避检光保存。37硝系益图恒酸。

温纤维放置素膜7d上，每，每天个测检点取测灰3滋免疫度L，变化于金鼓风溶液15滋L滴

，

制得干燥线箱性中

关2

结果与讨论

2.1

柠檬酸三钠最适加入量的确定

制得5组胶体金溶液的最大吸光度见图1、

表1。

12345Fig.1图Colloidal1不同还原gold剂加入量制备的胶体金reducingpreparedagents

byaddingdifferent

Tab.1表1Maximum不同还原剂absorption加入量制备的wavelength胶体金of最colloidal大吸收gold波长

by

试管序adding号different1reduction2doses345

还原剂加入量/mL1.21.41.61.82.0最大吸收波长/nm

530

529

528

524

520

速诊断20~40nm。文献报的道胶胶体体金金适最用大吸于制备免疫金，

用于快70nm）呈线性相关收波长与粒径（10~[8]。故此确定还原剂柠檬酸三钠

的最适加入量为16ml·L-1胶0.01%HAuCl4溶液，

此时40nm体金2.2之溶液最间佳反。

的最大吸收波长是528nm，粒径在20~

HAuCl应时间的确定

4与柠檬酸三钠反应时间过短，HAuCl还未完全被还原，若反应时间过长，胶体金溶液体4

系将不稳定，容易发生聚沉。因此，

需要确定最佳反应时间。取100mL0.01%HAuCl加热至沸腾后，加入柠檬酸三钠1.6mL4溶液，磁力搅拌并

。继续搅拌并

加热，可以看到溶液颜色由浅黄色、

黑色、紫色、深蓝10色值、见12、深图、14min红色、2，表2时透。

间明点澄取样清酒，红色检测的各变化样品。分最别大吸在6光度、8、

0.8Abs-10minAbs-8minAbs-6min0.7Abs-14minAbs-12min0.60.50.4

450

500

550600

波长/nm

图Fig.22不同Spectroscopy沸腾时间制备的胶体金的吸boilingofcolloidal光度谱图time

goldbydifferent

14曹涤非等：柠檬酸三钠法制备胶体金及其应用*2019年第12期

Tab.2表2Maximum不同沸腾时间制备的胶体金最大吸byabsorptiondifferent1boilingwavelengthofcolloidal收波长

gold

2time345沸腾时间/min68101214最大吸收波长/nm530529528524520最大吸收值/OD

0.6840.7090.7400.6530.658

当沸腾时间为14min时，胶体金溶液出现黑色粉末状沉淀。沸腾时间为10min时，最大吸收波长为2.3

528nm免疫，故金制备沸腾时最适间为10minpH值确是最佳定

反应时间。

的影响pH，值这对是胶因体为金蛋白颗粒的对净蛋白电荷的吸附取决于溶液作用有的很pH大值。实验中加入10%NaCl水溶液静置后，溶液颜色

发生不同程度的变化，

见图3。pH值：6.07.08.09.010.0ControlpHFig.3图值从Colloidal3不同9.0到10.0gold'spH值时stability胶体金的，of稳定different性

pH

红色2.4不最适变。因标此记抗，

确定体浓度胶体金的溶液溶液确最的定适颜pH色均值保为持9.0酒

。2.0滋g3.0滋g4.0滋g5.0滋g6.0滋gConrtolFig.4

胶体Colloidal图4不同金在弱gold's抗碱环境stability体加入量下带of胶负different体金的稳定电荷，

antibody性

可与蛋白addition

质分子的正电荷基团形成牢固的结合。胶体金溶液中加入的CA153抗体量过少时，溶液为灰色，

紫色。抗体量为5.0，6.0滋g的两组，静置2h后溶液颜色保持酒红色不变。因此，CA153抗体最少加入量为5.0滋g/200mL，即25.0滋g·mL-1。

2.5免疫金稳定性检测

检测硝酸纤维素膜上的免疫金灰度值，

制得线性关系曲线。实验结果显示，

免疫金灰度变化不显著。从线性数据看出，线性关系较好，

可见免疫金可保持较好的稳定性。

163.4163.2163.0162.8162.6yR=-0.1314x+163.452162.4

=0.99161

2

345

6

7

天数/d

Fig.5图Stability5免疫Curve金稳定of性immunogold

曲线

3结论

本文研究了柠檬酸三钠法制备胶体金的最优

条件，确定了最佳还原剂柠檬酸三钠加入量和反应时间。本研究检测了胶体金包被CA153抗体的最优条件，确定胶体金包被CA153抗体的最适pH值和

最适抗体加入量。研究检测了免疫金的稳定性。胶体金易于制备，成本低，可视化颜色形成较快且非常稳定[9]。目前，胶体金标记抗体被广泛应用在人类医学及动、植物医学检测，农产品和食品农药残留检测等领域[10,11]。本研究制备的包被CA153抗体免疫金可为临床检测CA153提供重要的技术手段。

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5］尹晋津，许利剑，曾晓希，等.生物检测用纳米金粒子还原制备

（下转第圆源页）

［［［［［24苟鑫宇等：RP-HPLC-UV法测定清心莲子饮中人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量*2019年第12期

2.9含量测定

（批号2019取3批不同批号的清心莲子饮样品

“2.1”0410，20190411，20190412），按照项下方法制“2.3”备供试品溶液，并按照项下色谱条件进样测定，将各个色谱峰面积代入线性回归方程计算清心

莲子饮中人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量，结果见表2。

文献，确定为203nm为人参皂苷Re、Rg1、Rb1最终

基线平稳，检测波长。结果各色谱峰响应值较高，杂峰相对较少。

4结论

本文采用RP-HPLC-UV法建立了对清心莲子

3

3.1

讨论

供试品处理方法的确定

饮中人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量测定方法，本方

在线性范围内具有较好的灵法科学合理、可重复、为敏度和选择性、具有良好分离度和稳定回收率，

可靠清心莲子饮有效成分的含量测定提供了快捷、的方法，为清心莲子饮的临床合理应用和质量控制

提供了实验依据和理论支持。

参考文献

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首先考察了标准清心莲子饮标准煎液处理时，

甲醇复溶后进样，煎液直接蒸干，发现有较强的杂后采用将标准质峰干扰，目标峰分离度不够理想，

煎液正丁醇萃取3次后回收正丁醇，甲醇复溶进样，该方法能够实现清心莲子饮中人参皂苷类成分

降低杂质干扰，发现色谱图基线平稳，灵敏的富集，

且峰面积的大小与化合物的含度和检测限均较好，

量具有线性关系，使得目标成分的分析更为快捷便利。

3.2检测波长的确定

为了确定人参皂苷Re、Rg1、Rb1的最佳检测波

长，对这3种化合物分别在190~400nm波长范围进203nm波长处有最大吸收，根据该结果并查阅相关行扫描，发现人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品溶液在

（上接第14页）

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