(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110438158 A(43)申请公布日 2019.11.12
(21)申请号 201810420761.0(22)申请日 2018.05.04
(71)申请人 中国科学院上海生命科学研究院
地址 200031 上海市徐汇区岳阳路320号(72)发明人 姜海 李晓曦 陈德桂 郑丽婷 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所(普通
合伙) 31219
代理人 李艳 许亦琳(51)Int.Cl.
C12N 15/87(2006.01)A01K 67/027(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图7页
(54)发明名称
一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的制备及应用(57)摘要
本发明属于转化医学和新药开发领域，具体涉及一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的制备及应用。本发明公开了一个全新的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的设计、交配、繁殖方法；公开了侵袭性淋巴瘤小鼠模型的肿瘤发生的性别特点和生存时间；公开了侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤的表型与组织特征及细胞类型分析。本发明首次构建了恶性侵袭性淋巴瘤的小鼠模型，该小鼠模型中淋巴瘤可自发发展侵犯脑等组织器官，与人类恶性淋巴瘤的特征非常相似，可用于抗肿瘤药物和疗法的体内研究，为肿瘤药物的临床前体内研究提供了重要的研究模型。CN 110438158 ACN 110438158 A
权 利 要 求 书
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1.一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：将自发B细胞淋巴瘤小鼠的UTX基因敲除，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，将自发B细胞淋巴瘤小鼠B细胞中的UTX基因敲除。
3.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用基因工程的方法敲除UTX基因。
4.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述自发B细胞淋巴瘤小鼠为Eμ-Myc转基因小鼠。
5.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，将自发B细胞淋巴瘤小鼠与B细胞特异缺失UTX基因的小鼠交配繁殖，从后代中筛选获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。
6.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠；(2)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(3)取步骤(1)中获得的雄性UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(2)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。
7.根据权利要求1所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(2)雄性Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(1)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。
8.如权利要求1～7之任一项所述构建方法制备获得的侵袭性淋巴瘤小鼠模型。
9.如权利要求1～7之任一项所述构建方法或如权利要求8所述的侵袭性淋巴瘤小鼠模型用于筛选侵袭性淋巴瘤治疗药物的用途。
10.一种筛选侵袭性淋巴瘤治疗药物的方法，包括步骤：将候选物质施用于如权利要求1～7之任一项所述构建方法获得的侵袭性淋巴瘤小鼠模型，若侵袭性淋巴瘤减弱，则可将该候选药物作为候选侵袭性淋巴瘤治疗药物。
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CN 110438158 A
说 明 书
一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的制备及应用
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技术领域
[0001]本发明属于转化医学和新药开发领域，具体涉及一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的制备及应用。
背景技术
[0002]在人类伯克利淋巴瘤中Myc基因与免疫球蛋白基因发生移位，引起c-Myc异常表达，最终诱发伯克利淋巴瘤发生。通过遗传工程方法，将μ基因的增强子元件和Myc基因即Eμ-Myc整合到小鼠基因组中，构建得到Eμ-Myc转基因小鼠。在该小鼠模型中，Myc特异在B细胞分化过程中异常表达，诱导小鼠发生自发淋巴瘤，表明Myc基因在淋巴瘤发生中的重要作用。
[0003]在Eμ-Myc转基因小鼠的整个生命周期中，半合子(Hemizygotes)Eμ-Myc小鼠的pre-B细胞在骨髓中大量增殖。野生型雌鼠与半合子雄鼠的半合子后代中，自发pre-B细胞和B细胞淋巴瘤在15-20周龄的发生率为50％。淋巴瘤源于在B细胞分化的不同时期的单个B淋巴样细胞克隆。
[0004]B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是淋巴瘤的主要类型，其中弥散大B细胞淋巴瘤(DLBCL)在B-NHL中的发生比例最高。在临床上，尽管淋巴瘤的黄金化疗方案CHOP/R-CHOP可以基本治愈60％的DLBCL患者，但是仍然有40％的DLBCL患者对CHOP/R-CHOP治疗方案无应答，这些患者中大部分在治疗后期(4.7-9.0个月)，被进一步检测出淋巴瘤侵犯中枢神经系统CNS，如果发生CNS侵犯，这类病人的治疗效果非常不理想，随后的生存期仅为2-5个月。[0005]但是现有技术中并没有能够很好地模拟人类病人的动物模型。[0006]因此，开发相关的淋巴瘤动物模型，对于研究淋巴瘤的复发和CNS侵犯，以及开发对应的有效化疗方案具有重要意义，是治疗恶性淋巴瘤的关键。发明内容
[0007]为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的制备及应用，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型可用于新药开发过程中的临床前研究。[0008]为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：[0009]本发明的第一方面，提供一种侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：将自发B细胞淋巴瘤小鼠的UTX基因敲除，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0010]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤侵犯到淋巴节外器官。[0011]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤侵犯到头部。[0012]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型发生了脑侵犯。[0013]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤侵犯到胸腔。[0014]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型发生了胸腺侵犯。[0015]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤侵犯到腹腔。[0016]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型发生了腹腔侵犯。
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说 明 书
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在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤周围发生了大量血管生
成。
在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型比自发B细胞淋巴瘤小鼠的淋巴
瘤的血管更明显。
[0019]在一种实施方式中，将自发B细胞淋巴瘤小鼠B细胞中的UTX基因敲除。[0020]在一种实施方式中，采用基因工程的方法敲除UTX基因。[0021]在一种实施方式中，将自发B细胞淋巴瘤小鼠与B细胞特异缺失UTX基因的小鼠交配繁殖，从后代中筛选获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0022]在一种实施方式中，所述自发B细胞淋巴瘤小鼠为Eμ-Myc转基因小鼠。[0023]在一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：[0024](1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠；(2)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(3)取步骤(1)中获得的雄性UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(2)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0025]在另一种实施方式中，所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(2)雄性Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(1)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0026]本发明的第二方面，提供前述构建方法获得的侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0027]本发明的第三方面，提供前述构建方法或前述构建方法获得的侵袭性淋巴瘤小鼠模型用于筛选侵袭性淋巴瘤治疗药物的用途。[0028]本发明的第四方面，提供一种筛选侵袭性淋巴瘤治疗药物的方法，包括步骤：将候选物质施用于前述构建方法获得的侵袭性淋巴瘤小鼠模型，若侵袭性淋巴瘤减弱，则可将该候选药物作为候选侵袭性淋巴瘤治疗药物。[0029]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030]本发明公开了一个全新的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的设计、交配、繁殖方法；公开了侵袭性淋巴瘤小鼠模型的肿瘤发生的性别特点和生存时间；公开了侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤的表型与组织特征及细胞类型分析。本发明首次构建了恶性侵袭性淋巴瘤的小鼠模型，该小鼠模型中淋巴瘤可自发发展侵犯脑等组织器官，与人类恶性淋巴瘤的特征非常相似，可用于抗肿瘤药物和疗法的体内研究，为肿瘤药物的临床前体内研究提供了重要的研究模型。
附图说明
[0031]图1A：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法。[0032]图1B：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的另一种构建方法。[0033]图1C：获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠作为实验对照。
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[0018]
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图2：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的肿瘤发生的性别特点和生存时间。图3：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的特征。图4：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的特征补充。图5：侵袭性淋巴瘤小鼠模型的细胞起源分析。
具体实施方式
[0038]本发明主要发明了一种可自发发生脑侵犯和血管形成的淋巴瘤动物模型，该发明可用于侵袭性淋巴瘤的基础研究及新药开发过程中的临床前动物实验研究。[0039]与其他淋巴瘤小鼠模型相比，基因工程小鼠和转基因小鼠模型中的自发淋巴瘤的发展被认为更接近生理微环境，这些淋巴瘤的发展是处于非人为选择压力的条件下。与免疫缺陷小鼠相比，这些基因工程淋巴瘤小鼠模型是免疫正常的，与人类淋巴瘤的临床相关性更强。而且，在完整的免疫系统里，这些淋巴瘤处于正常的生物和免疫环境中，细胞因子和效应细胞的功能能被更精确地研究。Eμ-Myc转基因小鼠是一个典型的基因工程淋巴瘤小鼠模型，该小鼠模型携带免疫球蛋白基因重链的Eμ增强子序列和原癌基因c-myc，导致pre-B细胞和或B细胞发生恶性增殖。
[0040]人类癌症基因组研究发现，UTX在多种癌症中发生大量突变或删除，并且这些突变很多是失活突变，因此，UTX可能是一个抑癌基因。通过CD19-Cre工具小鼠和被loxP序列打靶的UTX小鼠交配，得到了B细胞特异敲除UTX的小鼠，进一步与Eμ-Myc转基因小鼠杂交后，得到了一个全新的基因工程与转基因小鼠模型，该模型可以用于研究UTX缺失的淋巴瘤的发生特征以及新药的临床前动物实验研究。
[0041]在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。[0042]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0043]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic
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Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。[0044]实施例1[0045]一、材料
[0046]自发B细胞淋巴瘤小鼠：亦即Eμ-Myc转基因小鼠，购买于美国杰克逊实验室(The Jackson laboratory)。
[0047]UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠，构建和来源于陈德贵实验室(生物化学与细胞生物学研究所)。
[0048]本发明中出现的所有小鼠的品系均为C57BL/6背景。所有小鼠按照标准的实验动物饲养方法饲养在无特定微生物(SPF)屏障中。
[0049]所有动物饲养均遵循上海市实验动物管理规范以及中科院上海生物化学与细胞生物学研究所实验动物管理规章制度。[0050]二、构建侵袭性淋巴瘤小鼠模型
[0051]本发明的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法的核心在于，将传统的自发B细胞淋巴瘤小鼠(例如Eμ-Myc转基因小鼠)的B细胞中的UTX基因敲除，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。所述侵袭性淋巴瘤小鼠模型为恶性程度更高的自发B细胞淋巴瘤小鼠模型。[0052]具体地，可在传统的Eμ-Myc转基因小鼠即自发B细胞淋巴瘤小鼠的基础上，通过与B细胞特异缺失UTX基因的小鼠交配繁殖，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。[0053]如图1A所示，侵袭性淋巴瘤小鼠模型的繁殖有一些要求，其中Eμ-Myc转基因位点需要通过半合子Eμ-Myc雄鼠和野生雌性小鼠的交配方式进行保持。[0054]具体地，如图1A所示，侵袭性淋巴瘤小鼠模型的构建方法，包括步骤：(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠；(2)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(3)取步骤(1)中获得的雄性UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(2)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性淋巴瘤小鼠模型。其中，一个UTX基因拷贝被敲除的雄鼠以及两个UTX基因拷贝均被敲除的雌鼠，均具有成为侵袭性淋巴瘤小鼠模型的潜力。[0055]其中，构建UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠时，可通过DNA同源重组方法，打靶载体中含有LoxP序列的一段DNA序列，与小鼠ES细胞(胚胎干细胞)基因组中同源序列进行替换，从而在小鼠基因组中UTX基因的第10号和第14号内含子中插入LoxP序列，进而繁育成经过基因打靶修饰的野生型小鼠。UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠的构建属于现有技术，可参照Liting Zheng,Longyong Xu.Qing Xu,Lu Yu,Danfeng Zhao,Pu Chen,Wei Wang,Yiqin Wang,Gang Han,Charlie Degui Chen.Utx loss causes myeloid transformation.Leukemia.2018Feb 20。[0056]如图1B所示，侵袭性淋巴瘤小鼠模型的另一种构建方法，包括步骤：(1)雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Cre转基因工具小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠；(2)雄性Eμ-Myc转基因小鼠与步骤(1)中获得的雌性UTX基因在B细胞中特异敲除小鼠交配，获得UTX基因在B细胞中特异敲除的Eμ-Myc转基因小鼠，筛选，获得侵袭性
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淋巴瘤小鼠模型。其中，一个UTX基因拷贝被敲除的雄鼠以及仅一个UTX基因拷贝被敲除的雌鼠，均具有成为侵袭性淋巴瘤小鼠模型的潜力。[0057]如图1C所示，雌性UTX基因经过基因打靶修饰的野生型小鼠与雄性Eμ-Myc转基因小鼠交配，获得UTX基因经过基因打靶修饰的Eμ-Myc转基因小鼠，作为实验对照。[0058]二、侵袭性淋巴瘤小鼠模型的肿瘤发生的特点和生存时间[0059]对上述图1A所示繁殖方案、图1B所示繁殖方案、图1C所示繁殖方案中所得结果分别进行统计，结果如表1-1、表1-2和表1-3所示：[0060]表1-1繁殖方案-图1A的小鼠出生比例
[0061]
[0062]
表1-2繁殖方案-图1B的小鼠出生比例
[0063]
[0064]
表1-3繁殖方案-图1C的小鼠出生比例
[0065]
由此，可知，上述图1A所示繁殖方案、图1B所示繁殖方案、图1C所示繁殖方案，所得
小鼠进行基因型鉴定和统计，获得了各基因型小鼠的出生数量，这些小鼠的出生比例符合孟德尔遗传定律，说明这些基因修饰和敲除对于小鼠早期发育影响很小。[0067]此外，我们对图1A、图1B和图1C中繁殖方案获得的目的基因型小鼠和对照基因型小鼠进行正常饲养，观察小鼠发病情况，通过每周对小鼠腋下淋巴结进行触摸检测，对小鼠的自发淋巴瘤发生的情况进行监测，并记录出生和死亡日期，根据每个基因型小鼠的生存时间绘制生存曲线图，得到了图2的结果。目的基因型小鼠如图2中蓝线和绿线所示，蓝线分别代表一个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雄鼠和两个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雌鼠，绿线代表一个UTX基因拷贝敲除的Eμ-Myc雌鼠，对照基因型小鼠如图2中红线和黑线所示，红线代表UTX基因修饰的Eμ-Myc雄鼠和雌鼠，黑线代表UTX基因修饰的雄鼠和雌鼠。[0068]目的基因型小鼠，即UTX基因在B细胞中被敲除的Eμ-Myc小鼠，简写成Eμ-Myc；UTX KO，共有3种基因型类别，这三种基因型小鼠均具有自发发生恶性侵袭性淋巴瘤的疾病发生
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[0066]
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潜力。这3种基因型详细信息如下：[0069]基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/y；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/y,即一个UTX基因拷贝被敲除的Eμ-Myc雄鼠，见表1-1和表1-2，对应于图2雄鼠生存曲线中的蓝线。[0070]基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/f；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/-,即两个UTX基因拷贝均被敲除的Eμ-Myc雌鼠，见表1-1，对应于图2雌鼠生存曲线中的蓝线。[0071]基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/+；CD19-Cre-/+，简写成Eμ-Myc；UTX-/+,即一个UTX基因拷贝被敲除的Eμ-Myc雌鼠，见表1-2，对应于图2雌鼠生存曲线中的绿线。[0072]对照基因型小鼠，即UTX基因发生修饰的Eμ-Myc小鼠和UTX基因在B细胞中被敲除的小鼠，分别简写成Eμ-Myc；UTXf/y和UTX-/y(雄鼠)，Eμ-Myc；UTXf/f和UTX-/-(雌鼠)，对应4种基因型类别，详细信息如下：[0073]基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/y，即一个UTX基因拷贝发生修饰的Eμ-Myc雄鼠，见表1-3，对应于图2雄鼠生存曲线中的红线。[0074]基因型表示为Eμ-Myc；UTXf/f，即两个UTX基因拷贝均发生修饰的Eμ-Myc雌鼠，见表1-3，对应于图2雌鼠生存曲线中的红线。[0075]基因型表示为UTXf/y；CD19-Cre-/+，简写成UTX-/y,即一个UTX基因拷贝在B细胞中被敲除的雄鼠，见表1-1和表1-2，对应于图2雄鼠生存曲线中的黑线。[0076]基因型表示为UTXf/f；CD19-Cre-/+，简写成UTX-/-,即两个UTX基因拷贝在B细胞中均被敲除的雌鼠，见表1-1，对应于图2雌鼠生存曲线中的黑线。[0077]补充说明，UTX基因发生修饰的Eμ-Myc小鼠与传统的Eμ-Myc小鼠类似，会发生自发淋巴瘤，但这些小鼠发生的自发淋巴瘤的恶性程度很低，淋巴瘤很少侵犯到淋巴节外器官，并且淋巴瘤周围未见明显血管生成，而UTX基因在B细胞中被敲除的小鼠存活和繁殖良好，未见淋巴瘤方面的疾病特征。[0078]如图2所示，侵袭性淋巴瘤小鼠模型与图1C繁殖方案所得对照小鼠相比，在淋巴瘤发生比例和淋巴瘤发生时间上都有非常大的提高，在雌鼠中，显示出淋巴瘤的发生是UTX剂量依赖性特征。图2中分别显示了雄性和雌性小鼠各基因型的肿瘤发生的特点和生存时间。[0079]三、侵袭性淋巴瘤小鼠模型中各基因型小鼠的淋巴瘤原位发生特征[0080]当触摸到小鼠的腋下淋巴瘤发生明显肿大和小鼠出现病态时，对小鼠实施安乐死，并对小鼠尸体进行解剖和拍照，并对小鼠的脾脏的大小进行测量和拍照记录，分别得到了图3中A、B、C的结果。进一步，对小鼠的脾脏进行固定和包埋，制作石蜡切片和HE染色，对脾脏内的生发中心结构进行组织学分析，得到了图3中D的结果。详细过程如下，HE染色组化分析的方法包括如下步骤：颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠脾脏和淋巴瘤，浸泡在卡诺氏固定液中4℃固定过夜，使用正丁醇脱水，每次12小时，共4次，浸蜡每次24小时，共3次，石蜡包埋后，制成5um超薄石蜡切片，采用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105#碧云天)进行染色，染色步骤按照说明书进行，经二甲苯梯度脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精室温染色十分钟，10mM NaOH溶液浸泡几秒钟至组织切片变蓝，浸泡95％乙醇后，伊红染色1-2分钟，95％乙醇清晰伊红染液，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色结果使用OLYMPUS BX51正置荧光显微镜进行观察并拍照。
[0081]对发生淋巴瘤侵犯头部的小鼠，去除了头部表皮，对头骨侧面进行拍照，得到了图3中E、F的结果。对淋巴瘤侵犯胸腔的小鼠，将胸腔内的淋巴瘤组织和肺组织取出，进行拍
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照，得到了图3中G、H的结果。对发生淋巴瘤侵犯头部和胸腔的小鼠的数量进行统计和分析，得到了图3中I的结果。对小鼠的淋巴瘤周围发生了大量血管生成的进行拍照记录，得到了图3中J、K的结果。[0082]如图3所示，人类恶性淋巴瘤的表现非常复杂，包括容易复发并发生中枢神经系统侵犯和胸腺侵犯等等，该侵袭性淋巴瘤小鼠模型显示出的一系列特征与人类恶性淋巴瘤的特征非常类似。图A显示了各基因型小鼠的淋巴瘤原位发生特征，可以发现，Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤的血管更明显，图B和图C显示了各基因型小鼠的脾脏大小，图D显示了各基因型小鼠的脾脏组织的HE染色结果，Eμ-Myc；UTX KO小鼠的脾脏的生发中心破坏更严重，图E和图F显示Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了脑侵犯，图G和图H显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了胸腺侵犯，图I显示了发生脑和胸腺侵犯在各基因型中的发生比例，图J和图K显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了明显的血管生成现象。[0083]四、侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤发生特征[0084]由于自发淋巴瘤模型的表征特别复杂多样，我们进一步呈现了一部分侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤发生特征，其中图4A是图3E、F的补充，图4B是图3G、H的补充，图4C、D是图3J、K的补充，而图4E是部分小鼠的淋巴瘤侵犯腹腔的图片。[0085]如图4所示，这些补充图片更加充分体现出该该侵袭性淋巴瘤小鼠模型的淋巴瘤发生特征。图A和图B显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生脑和胸腺侵犯的例子，图C显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了明显的血管生成现象，图D显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了明显的血管生成现象的原位图像，图E显示了Eμ-Myc；UTX KO小鼠的淋巴瘤发生了腹腔侵犯。[0086]五、侵袭性淋巴瘤小鼠模型的细胞起源分析：[0087]我们对各基因型小鼠发生的淋巴瘤进行分离，并通过流式细胞染色进行细胞表面分子表达分析，对淋巴瘤是起源于B细胞分化发育的哪个阶段进行分析，得到了图5中的结果。其中，流式细胞分析包括如下步骤：分别取对应小鼠的脾脏、骨髓与淋巴瘤，在流式缓冲液(1％BSA PBS)中，使用玻璃片毛面挤压组织制成细胞悬液，使用滤网过滤细胞得到单细胞悬液，离心后，使用红细胞裂解液(ACK)重悬细胞，在37℃水浴锅中裂红5分钟，离心后，使用流式缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪计数，取1x106细胞至新FACS管，加入0.5ml流式缓冲液重悬细胞，离心后，同时每30ul流式缓冲液中加入0.2ul对应抗体，制成抗体染色液，每个样品使用30ul抗体染色液重悬，放入4℃冰箱避光染色40分钟至1小时。使用3ml流式缓冲液稀释抗体染色液，离心后，使用200ul缓冲液重悬样品，使用流式细胞仪进行检测。[0088]人类淋巴瘤的细胞起源与淋巴瘤的预后和治疗密切相关，大多数人类恶性淋巴瘤起源于成熟B细胞。通过流式细胞表面分子标记分析，如图5所示，本发明的侵袭性淋巴瘤小鼠模型的细胞主要起源于B淋巴细胞发育的后期，与人类淋巴瘤的细胞起源相似。图A显示了各基因型小鼠的淋巴瘤的细胞起源分布比例来，图B是B淋巴细胞的细胞起源分子标记示意图。
[0089]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更
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动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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图1A
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图1B
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图1C
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图2
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图3
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图4
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图5
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