血管性痴呆大鼠模型制作方法的改良

２０１５年１２月　中国实验动物学报　ＡＣＴＡ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＵＭ　ＡＮＩＭＡＬＩＳ　ＳＣＩＥＮＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ　１）ｅｃｅｍｂｅｒ　２ＯＩ５　第２３卷第６期　Ｖ０１．２３　Ｎｏ．６　血管性痴呆大鼠模型制作方法的改良　顾静　。，李海龙　，杨长生。，车敏　，吴红彦　，　甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州７３００００；２．甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，兰州７３００００　３．甘肃省中药新产品创制工程实验室，兰州　７３００００）　【摘要】　目的靠。方法对血管性痴呆（ＶＤ）大鼠模型的造模方法进行改进，使血管性痴呆的实验研究更加科学叮　采用“反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单侧永久结扎颈总动脉法”制备ＶＤ大鼠模型，并用脑复　康（吡拉西坦）加以模型验证。实验从大鼠行为学和组织病理两个方面评价ＶＤ模型。结果　实验结果显示：对比　假手术组，模型组大鼠定位航行潜伏期延长，空间搜索穿越平台次数减少，海马病理切片显示：细胞数量较少、细胞　轮廓模糊皱缩、胞质深染、核不清晰；脑复康阳性药物对照组上述指标明显改善。结论　硝普钠注射量为２．０　ｍｇ／　ｋｇ时，手术室温控制在２８＇（２且术后２４　ｈ内控制在２５ｑＣ，大鼠状态稳定，死亡数减少；术中反复阻断ｊ次双侧颈总动　脉后直接永久性结扎左侧颈总动脉，可以切断大约三分之一的脑供血，造成慢性脑供血不足状态，更接近ＶＤ发病　机制。　【关键词】　血管性痴呆；大鼠模型；吡拉西坦；脑；海马；外科手术；病理学　【中图分类号】Ｑ９５—３３　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００５—４８４７（２０１５）０６－０６３４－０５　Ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５—４８４７．２０１５．０６．０１７　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｅｓｔａ　！：ｓｈ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ　ＧＵ　Ｊｉｎｇ　，ＬＩ　Ｈａｌ—ｌｏｎｇ　，ＹＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ—ｓｈｅｎｇ　，ＣＨＥ　Ｍｉｎ　，ＷＵ　Ｈｏｎｇ　ｙａｎ　’　（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　３ｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈｅｒｂｓ　ａｎｄ　Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ，７３００００；３．Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ　ｆｏｒ　ＴＣＭ　Ｎｅｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００００．）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ　ａｎｄ　ｔｏ　ｂｅｔｔｅｒ　ｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅｓ　ｏｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　研　　ｓｔｕｄｉＷｅ　ｕｓｅｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ“ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ＣＯｒｎ—　ｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ｌｉｇａｔｉｏｎ”ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｐｉｒａｃｅｔａｍ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｖａｌｉｄａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ａｎｄ　ｈｉｓｔｏｐａ・　究％　一报ｊ；　告。　ｈ；　ｔｈｏｌｏｇｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｓ　ｏｆ　ｐｒｅｖｉｏｕｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｎｊｍ：ｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　２．０　ｍｇ／ｋｇ，ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ａｔ　２８℃ｄｕｒｉｎｇ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｋｅｐｔ　ａｔ　２５　ｒａ・　ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｒｓ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅａｔｈ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，“ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ｌｉｇａｔｉｏｎ”　ｃｏｕｌｄ　ｃｕｔ　ｏｆｆ　ａｂｏｕｔ　ａ　ｔｈｉｒｄ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｓｕｐｐｌｙ，ａｎｄ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｅｈｅｍｉａ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｓｅｅｍｉｎｇｌｙ　ｉｎｏｒｅ（１＇０１１一　ｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｌｈｅ　ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｐｅｒｉｏｄ　ｗａｓ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ａｎｄ　ｓｐａｃｅ　ｓｅａｒｃｈ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅｃａｍｅ　ｗｏｒｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｃｅｌｌ　ｎｕｍ１）ｅｒ　ｗａｓ　ｄｅ—　ｃｒｅａｓｅｄ，ｗｉｔｈ　ｂｌｕｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔｏｕｒ　ａｎｄ　ｄｅｅｐｌｙ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅｉ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ（＇ｌｅａｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｉｐｐｕ（，＇ａｍｐａｌ　ｔｉｓｓｕｅ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｏｕｒ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ”ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｊｅ（－一　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｎ｜ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ　ｌｉｇａｔｉｏｎ”ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｅｓｔａｈｌｉｓｈ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｕｓｉｎｇ　ｐｉｒａｃｅｔａｍ　ｖａｌｉｄａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｃａｎ　ｂｃ　ｉｌＳｅ（１“１　［基金项目］甘肃省中药药理与毒理学重点实验室自主课题（ＺＤＳＹＳ－ＺＺＫＪ．２０１３（Ｂ）－００４）；国家自然科学基金（８１０６０２８４）　［作者简介］顾静（１９８０一），女，副教授，博士，主要从事心血管药理生理学研究。Ｅｍａｉｌ：１２０２３３２３４＠ｑｑ．ｃｏｌｌｌ　［通讯作者］吴红彦（１９６３一），男，教授，博导，主要从事老年病学研究　Ｅｍａｉｌ：ｇｕｊｉｎｇｌ２０２３３２３４＠１２６．ｃｏｎｌ　中国实验动物学报２０１５年ｌ２月第２３卷第６期Ａｃｔａ　Ｌａｂ　Ａｎｉａｔ　Ｓｅｉ　Ｓｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１５，Ｖｏ１．２３　Ｎｏ．６　６３５　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ—ｒｅｌａｔｅｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ；Ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ；Ｐｉｒａｃｅｔａｍ；Ｂｒａｉｎ；Ｈｙｐｐｏｃａｍｐｕｓ；Ｓｕｒｇｅｒｙ；Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　血管性痴呆（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＶＤ）是由脑血管　病（如脑梗塞、脑出血、皮层下白质的缺血性改变）引　起的以记忆、认知功能缺损为主的获得性智能持续性　损害。病理变化可见脑实质细胞凋亡，数目减少，脑　缩小。近年来血管性痴呆已成为我国中老年人的多　发病。但目前国内外对控制本病病程进展尚无有效　方法和药物，因此急需相关基础研究以开发有效药　物，相应的ＶＤ动物模型构建至关重要。　大鼠与人类有相似的脑血管解剖学结构，脑供　血系统由颈动脉系和椎底动脉系合成动脉环，通过　分支完成脑供血。建立准确、高真的ＶＤ大鼠模型，　对深入探讨ＶＤ的病因病机、病理学特点以及早期　诊断和防治具有重要意义。近年来有关血管性痴呆　模型制作的研究不断完善，制作方法多样，例如常用　的有：两血管阻断法及改良法（２－ＶＯ）　。　、三血管　阻断法（３一ＶＯ）。。’　、四血管阻断法（４一ＶＯ）、大脑中　动脉梗死法、血管栓塞法、ＶＤ自发模型　和去大　脑皮层法等多种方法，各种方法仍有弊端，例如：关　于“硝普钠注射量，环境温度要求，反复阻断再灌注　造成短暂性脑缺血，术后大鼠可能会恢复”等问题　有待改良。为了使血管性痴呆实验更加科学，ＶＤ　大鼠模型制作更易成功，本研究参考分析上述这些　造模方法并做一改进，采用“反复夹闭颈动脉加注　射硝普钠降压再加单侧永久结扎颈总动脉法”制备　血管性痴呆大鼠模型，并用脑复康（吡拉西坦）加以　模型验证。　１材料与方法　１．１　材料　ＳＰＦ级Ｗｉｓｔａｒ大鼠３０只，体重２４０～２６０　ｇ，６０　日龄，来源于甘肃中医学院科研实验动物中心　【ＳＣＸＫ（甘）２０１１—０００１—６２００１０００００００６２】，无菌　手术在甘肃中医学院科研实验动物中心进行　【ＳＹＸＫ（甘）２０１３—０００１—００００００７７】。饲料由甘肃　中医学院科研实验动物中心提供。多聚甲醛等基础　试剂购白天津科化，脑复康（吡拉西坦胶囊，陕西白　鹿制药股份有限公司），脑复康药液的配制：用双蒸　水配制成浓度为０．０９　ｇ／ｍＬ水溶液，４℃储存备用；　水合氯醛（上海化学试剂五联化工厂），用生理盐水　配制成１０％注射液；注射用硝普钠（湖南中南科伦　药液有限公司），用双蒸水配制成浓度０．８　ｍｇ／ｍＬ　注射液，避光保存。　１．２实验方法　１．２．１　血管性痴呆（ＶＤ）大鼠模型制备　采用反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单　侧永久性结扎颈总动脉法。大鼠术前禁食、水，用　１０％水合氯醛麻醉，常规消毒，颈正中切口，分离双　侧颈总动脉，模型组及药物治疗组在夹闭双侧颈总　动脉之前，腹腔注射硝普钠（２．０　ｍｇ／ｋｇ），随即用无　创动脉夹夹闭双侧颈总动脉１０　ｍｉｎ，随后去除动脉　夹通血１０　ｍｉｎ，共间歇阻断一再通双侧颈总动脉血　流３次，之后结扎一侧颈总动脉，缝合伤口、保温饲　养。假手术组仅分离双侧颈总动脉・。术后肌注庆大　霉素预防感染。　１．２．２动物分组及给药　大鼠随机分为３组：假手术组（空白对照组）、　模型组、阳性对照组（脑复康）。阳性对照组给予脑　复康灌胃（０．３２４　ｇ／ｋｇ），假手术组、模型组给予等量　生理盐水，每日一次，连续灌胃２３　ｄ。　１．２．３　Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫行为学检测　Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫可用于检测大鼠空间学习记忆能　力。分为定位航行实验和空间搜索实验两部分。训　练开始时将大鼠任意从四个象限之一面向池壁入　水，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间（逃　逸潜伏期）。每次大鼠共游１２０　Ｓ寻找平台，若成功　找到给予１５　Ｓ休息时间，若未找到，将其引至平台也　休息ｌ５　ｓ，逃逸潜伏期为１２０　Ｓ。连续训练４　ｄ，上午２　次，下午２次。第５天撤去平台，将大鼠面向池壁放　入水中找记忆平台，每只大鼠限时游６０　Ｓ，记录其６０　Ｓ内游过原平台相应位置的次数。数据采集和处理　由Ｍｏｒｒｉｓ迷宫图像自动监视处理系统完成。　１．２．４海马组织病理切片观察　禁食１２　ｈ颈椎脱臼处死大鼠，使头置于冰块上　开颅取出脑，冰盘上剥离取出大脑皮质及海马，保存　于一８０℃备用。　将海马放入４％多聚甲醛溶液中固定２４　ｈ，常　规乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋；海马区石　蜡切片、脱蜡、复水、苏木素染色；盐酸乙醇分化、伊　红复染、乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。　光学显微镜下观察。　１．３统计学处理　实验数据均以元±Ｓ表示，两组间比较采用独立　６３６　中国实验动物学报２０１５年ｌ２月第２３卷第６期Ａｃｔａ　Ｌａｂ　Ａｎｉｍ　Ｓｃｉ　Ｓｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１５，Ｖｃ，１．２３．Ｎｏ．６　样本ｔ检验，多组问比较采用单因素方差分析，数据　处理用ＳＰＳＳ　２０．０软件完成，以Ｐ＜０．０５认为差异　具有统计学意义。　穿越平台次数显著减少了７０％，差异有显著性（　Ｐ　＜０．０５），与模型组比较阳性对照组大鼠穿越平台　次数增加了１倍左右，差异有显著性（‘Ｐ＜０．０５）。　２．２海马组织病理切片观察　２　结果　２．１　Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫行为学检测结果　水迷宫定位航行实验结果如表１，图１Ａ、１Ｂ（图　中亮色曲线是大鼠在水池中的游动轨迹，图２１游动　轨迹越短说明大鼠用越短的时间爬上平台，即逃逸　时间越短；图１Ｂ游动轨迹穿越平台区（图中最小圆　形区）次数越多说明在一定时间大鼠找到平台的次　根据大鼠海马病理切片显示的神经细胞特点，　从细胞轮廓、细胞数量、胞质深染程度、胞核清晰度　等４个方面描述评价神经细胞损伤程度。每个观察　指标按下述标准依次评分为１、２、３分，各指标累计　评分越高表示细胞损伤越严重。　根据表２，图２大鼠海马病理切片分析：假手术　组４个观察指标海马神经细胞损伤合计为４分，模　型组为１２分，阳性对照组为１０分（模型组和阳性对　照组图中圈内为细胞固缩深染主要区域）。因此大　鼠海马病理切片分析结果显示：与假手术组比较，模　数越多。根据图片显示大鼠认知能力与数据分析结　果趋势一致。）显示：模型组与假手术组比较，大鼠　逃逸潜伏期明显增长（５．７倍），差异有显著性　（　Ｐ＜０．０５），与模型组比较阳性对照组大鼠逃逸潜　型组海马神经细胞数量较少、细胞轮廓模糊皱缩、胞　质深染、核不清晰，损伤严重；与模型组比较，阳性对　照组海马神经细胞损伤程度均有好转。　伏期缩短了３５．２％，差异有显著性（‘Ｐ＜０．０５）；空　间搜索实验结果显示：模型组与假手术组比较，大鼠　表１水迷宫检测（ｉ±ｓ）　Ｔａｂ．１　Ｒｅｓｕｈｓ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｍａｚｅ　ｔｅｓｔ　注：与假手术组比较　Ｐ＜０．０５，与模型组比较　Ｐ＜０．０５。　Ｎｏｔｅ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，　Ｐ＜０．０５；ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，▲Ｐ＜００５　．表２病理切片细胞损伤评分表　Ｔａｂ．２　Ｓｃｏｒｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｄａｍａｇｅ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　３　讨论　３．１　常用ＶＤ大鼠模型复制法分析　操作简便却存在较高的死亡率。　３．１．２　２一ＶＯ改良法　这种改良法又包括以下四种：①分次结扎颈总　动脉法：分两次结扎颈总动脉，间隔一星期，此方法　西医认为血管性痴呆病因主要是脑血管病变引　起供血不足而致脑组织缺血缺氧性改变，最终使大　脑功能全面衰退。基于这一基本理论，目前ＶＤ大　鼠模型构建也多采用脑血管阻断或辅以其他减少脑　血流的方法制备动物模型。下面针对目前常用的　能降低动物死亡率，且大鼠海马区变性、坏死程度　２－ＶＯ法变相似　’　；②２－ＶＯ法联合高血脂症：高脂　饲料喂养大鼠一个月，确定血脂升高后再用２－ＶＯ　法，此方法模拟了高脂血症引发ＶＤ的发病机　ＶＤ大鼠模型的制作方法进行优劣分析。　３．１．１　两血管阻断法（２－ＶＯ）　制　；③。肾血管高血压法：夹闭大鼠双侧肾动脉，　造成肾血管性高血压模型，４３　ｄ后阻断再通双侧颈　总动脉。此模型与人类高血压脑动脉损害相似；④　反复阻断一再灌注联合并腹腔注射硝普钠：夹闭双侧　２－ＶＯ法是将大鼠双侧颈总动脉（ｃｏｍｍｏｎ　ｃａ—　ｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｙ，ＣＣＡ）永久性结扎，使大脑处于慢性低　灌注状态，造成海马区、皮层等缺血缺氧损伤。此法　ＣＣＡ之前，腹腔注射硝普钠降低血压，加重脑缺血　６３８　中国实验动物学报２０１５年ｌ２月第２３卷第６期　Ａｃｔａ　Ｌａｂ　Ａｎｉｍ　Ｓｃｉ　Ｓｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２０１５，Ｖｏ１．２３．Ｎｏ．６　续低灌注共同导致的ＶＤ，与长期高血压后中风ＶＤ　高度相似，是比较理想的ＶＤ模型，但与非高血压　ＶＤ发病情况不一致，而且来源限制性，价格昂贵等　原因限制此方法在实验中的应用　。　３．１．８去大脑皮层法　大脑皮层法是将除去大鼠软脑膜血管，模型可　使大鼠皮质、海马等处细胞造成损伤，贴切的模拟了　ＶＤ病理改变，缺点是打开硬脑膜时对动物损伤过　大，导致动物死亡率高。　３．２　“反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单　侧永久结扎颈总动脉法”制备血管性痴呆大鼠模型　通过对ＶＤ大鼠模型制作方法的研究，我们认　为“２－ＶＯ改良法一反复阻断再灌注联合腹腔注射硝　普钠法”重复性、稳定性好，操作简单，对动物创伤　小，存活率高，并且与ＶＤ发病机制相似，但应该注　意两点：第一，此方法对硝普钠注射量、环境温度要　求较高；第二，考虑反复阻断再灌注造成短暂性脑缺　血，术后大鼠可能会恢复。基于此方法我们采用　“反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单侧永久　结扎颈总动脉法”制备血管性痴呆大鼠模型，通过　设立药物阳性对照组观察大鼠行为学、组织病理学　等指标分析模型构建情况。以下是本法对“２－ＶＯ改　良法一反复阻断再灌注联合腹腔注射硝普钠法”两　个问题的改良和分析：　第一，关于“硝普钠注射量、环境温度要求”的　问题改良：本实验开始前进行了预实验，摸索硝普钠　的注射条件，发现硝普钠注射量按文献２．５　ｍｓ／　ｋｇ　的量过大，所以对硝普钠剂量进行了实验研究。　实验分３个组制作ＶＤ模型，每组ｌ５只大鼠，注射　硝普钠剂量分别为２．５、２．０　ｍｇ／ｋｇ和没有注射硝普　钠，其他方法３组一致。结果２．５　ｍｇ／ｋｇ组大鼠死　亡率高达７３％，２．０　ｍｇ／ｋｇ组大鼠死亡率降至４０％，　没有注射硝普钠组大鼠死亡率为３３％，和２．０　ｍｇ／　ｋｇ组接近，因此确定硝普钠注射量为２．０　ｍｇ／ｋｇ　时，手术时室温控制在２８℃，术后２４　ｈ内控制在　２５￣（２时大鼠状态稳定，死亡数减少。　第二，关于“反复阻断再灌注造成短暂性脑缺　血，术后大鼠可能会恢复”问题的改良：手术中反复　阻断三次双侧颈总动脉后直接永久性结扎左侧颈总　动脉，这样可以切断大约三分之一的脑供血，造成慢　性脑供血不足状态，更接近ＶＤ发病机制。　另外需要说明的是，大鼠在水迷宫实验检测行　为记忆功能时，由于重复性实验会使动物记忆功能　受反复学习因素的影响，通过多次强化训练，其空间　搜索和定位航行能力提高，所以比较同只（组）大鼠　在造模前与造模后的行为记忆功能是不客观、不符　合实验需求的。因此本实验采用假手术组与模型组　造模后的组间比较，不进行同只（组）的造模前后比　较。　通过术后大鼠行为学和病理学检测，造模手术　后水迷宫定位航行实验结果显示造模组较假手术组　大鼠逃逸潜伏期明显增长，而空间搜索实验结果显　示在一定时间内模型组大鼠穿越平台区次数少于假　手术组，说明模型组大鼠学习记忆能力较假手术组　显著降低；ＨＥ病理切片也显示模型组较假手术组　海马区神经元细胞多数皱缩、消失，细胞间隙增宽、　排列紊乱，部分神经元细胞胞核固缩，神经细胞凋亡　程度高于假手术组，证明采用“反复夹闭颈动脉加　注射硝普钠降压再加单侧永久结扎颈总动脉法”制　造血管性痴呆大鼠模型比较理想。阳性对照药物脑　复康干预后，以上各指标均有改善，验证了此模型可　有效用于同类药物的开发和基础研究。　参　考　文　献　［１］　王兴华，李露斯．两种大鼠２－ＶＯ模型制作方法的比较［Ｊ］．　第三军医大学学报，２００４，２４（１２）：１４９６—１４９９．　［２】　黄文革，郭芬芬。刘慰华，等．血管性痴呆动物模型制作方　法的改良［Ｊ］．中国比较医学杂志，２０１１，２１（５）：４９—５２．　［３］　唐启盛，黄肩榴，郭建文．高脂斑症火鼠缺血再灌流诱发行　为学障碍模型的实验研究［Ｊ］．北京中医药大学学报，１９９７，　２０（５）：３４—３６．　［４］　雷燕，黄启福，王永炎．复圣散对高脂大鼠脑缺血再灌后的　脑保护作用［Ｊ］．中国中医基础医学杂志，１９９９，５（Ｉ２）：２２　—２５．　［５］　王蕊，杨秦飞．大鼠拟血管性痴呆模型的改进［ｊ］．中国病　理生理杂志，２０００，１６（１０）：９１４—９１６．　［６］　高东，周中和．血管性痴呆模型制作的问题［Ｊ］．国外医学老　年学分册，２００２，２３（２）：５９—６１．　［７］　Ｋａｍｅｙａｍａ　Ｍ．Ａ　ｎｅｗ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｂｉｌａｔｅｒａｌ　ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｉｎ　ｌｈｅ　ｒａｔ　ｔｈｒｅｅ　ｖｅｓｓｏ］ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，１９８５，１６：４８９　—４９６．　［８］　乔松，冯加纯，杨晶，等．自发性高血压和持续低灌流模型　大鼠记忆能力与脑组织病理学对比研究［Ｊ］．解放军医学杂　志，２００８，３３（６）：７２５～７２９．　［９］王超，张志国，贾晓旭．自发性高ｍ压大鼠脑损伤研究概况　『Ｊ］．中国药理学报．２００９．２５（１０）：１２７２—１２７４．　【收稿日期】２０１５—０６—１６