抗肿瘤药物研究及新药筛选

抗肿瘤药物研究及新药筛选

提 纲

一、化疗药物的发展 二、肿瘤的药物治疗 三、抗肿瘤药物筛选及评价 四、体外抗肿瘤活性试验 五、体内抗肿瘤活性试验

一、化疗药物的发展

• 近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。

• 50年代通过动物筛选化疗药物发现了5FU、MTX、CTX等，化疗学有了发展。

• 60年代认识到肿瘤细胞动力学及化疗药药代动力学的重要性。大部分目前所用的抗癌药已发现，有急淋、HD、睾丸癌等可化疗治愈。

• 70年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案。

• 80年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效，探索抗药性产生的原因，5%肿瘤患者可治愈。

• 90年代新抗癌药进入临床，多药耐药基因发现，生物治疗，基因治疗辅助治疗改善等，疗效进一步提高。

二、肿瘤的药物治疗

1、细胞毒类抗肿瘤药

a、拓扑异构酶抑制剂

原理：

真核细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ（Topo Ⅰ)是生物体内及其重要的细胞核内酶，参与DNA复制、转录和修复等所有关键的核内过程。DNA拓扑异构酶Ⅰ已成为重要的抗肿瘤药物研究新靶点。拓扑异构酶Ⅰ抑制剂已成为高选择性抗肿瘤药物研究的一个主攻方向。

代表药物：喜树碱类化合物

对S期的毒性作用，这一作用需共价TopoI－DNA复合物的形成和DNA复制。TopoI抑制剂诱导的细胞凋亡而非DNA断裂是引起细胞最终死亡的原因。

b、胸苷酸合成酶抑制剂

原理：

胸苷酸合成酶（TS）把单磷酸脱氧尿嘧啶（DUMP）转换成单磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA复制和细胞生长过程中起着关键作用。是已知抗肿瘤药物的重要有效靶点之一。胸苷酸合成酶抑制剂导致了DNA断裂从而导致细胞死亡。

代表药物：培美曲塞

它是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。体外研究显示，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰核苷酸甲酰转移酶活性，这些酶都是合成叶酸所必需的酶。一旦培美曲塞进入细胞内，它就在叶酰多谷氨合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂。多谷酸化在肿瘤细胞内呈现时间-浓度性过程，而在正常组织内浓度很底。多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长，从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。

c、铂类抗肿瘤药物

原理：

铂络合物产生抗肿瘤活性的原因，是由于其与肿瘤细胞DNA结合，从而干扰DNA的复制，抑制肿瘤细胞的分裂。

代表药物：顺铂和奥沙利铂

2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物

a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂

原理：

PTK是一组酶系，能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活各种底物酶，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。

代表药物：依马替尼

依马替尼一种抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，Bcr-Abl酪氨酸激酶是CML中由费城异常染色体引起的异常酪氨酸激酶。它能抑制Bcr-Abl阳性细胞系和费城染色体阳性CML新鲜白血病细胞的增殖并诱导其凋亡。

b、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂

原理：通过扩散进入肿瘤细胞，与 EGFR 的胞内段激酶结合区结合，从而抑制 EGFR 受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。

代表药物：吉非替尼

研究表明吉非替尼的作用通过上调 P27KIP1和 P21CIP/WAF1 的表达，导致细胞 G1 期阻滞或诱导细胞凋亡。

C、法尼基转移酶抑制剂

原理：

法尼基转移酶是近年来发现的与Ras蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶。抑制法尼基转移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖

代表药物：替匹法尼

3、肿瘤新生血管生成抑制药物

原理：

原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，开发和研究能够破坏或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物（称为TA 抑制剂），是新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一。

代表药物：angiostatin和endostatin Avastin

Endostatin可直接与血管内皮细胞受体结合抑制内皮细胞的增生；

_x000B_ 可与肝素样的硫酸蛋白结合，抑制血管生成；_x000B_ 可抑制VEGF等血管生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖 与肿瘤的生长；_x000B_ 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管内皮细胞凋亡加速。

4、肿瘤耐药逆转剂

原理：

根据肿瘤耐药的特点可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性而对其它药物不产生交叉耐药性，如抗代谢药甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧

啶(5-Fu)等；后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机制各异的药物也产生交叉耐药性，这是一种独特的广谱耐药现象。许多天然来源的抗肿瘤药物如秋水仙碱、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如阿霉素、柔红霉素都极易发生MDR。

肿瘤耐药产生的可能原因是药物代谢障碍、DNA修复机制障碍、DNA多聚酶活性改变等。另外，耐药是凋亡抑制的表现。一些与凋亡抑制相关的癌基因(如

bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表达产物可阻断或阻碍多种因素(如化疗药物、辐射、激素等)诱导的肿瘤细胞凋亡，产生耐药性。 研究表明MDR的产生是由于细胞内药物积聚发生障碍，此后研究证实细胞内药物积聚降低的同时，有一分子量约为170 000细胞膜蛋白过度表达，称之为P-糖蛋白(Pgp)

代表药物：钙拮抗药（维拉帕米及其衍生物）、钙调蛋白拮抗药（包括氯丙嗪等吩噻嗪类衍生物）、环孢素类（环孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素类化合物（他莫昔芬）等。

5、分化诱导剂

原理：

通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小、消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂。

代表药物：维A酸类化合物

咪唑衍生物利阿唑_x000B_

维A酸类化合物维甲酸类化合物(Retinoic acids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA)，它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件，从而调节靶基因的转录。

6、基因调节药物

a、反义药物

反义药物又称反义寡核苷酸药物（AODNs） ，是指人工合成长度为10～30个碱 基的DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的 基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。 AODNs 可以与其靶RNA链互补结合，形成RNA-DNA杂交双链。形成的杂交双链可以被RNA酶H识别并消化RNA链，由此释放出的 AODN可以继续与靶RNA链结合，最终导致编码基因沉默。由此可推RNA酶H过多表达可增强各种AODNs效应，反之RNA酶H受抑则降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反与翻译元件竞争空间因此可抑制RNA翻译。另外，AODNs 如果和mRNA结合可作用于内含子外显子接合处以中断其拼接过程。AODNs还可以占领校正RNA细胞内定位的蛋白－RNA作用序列，从而扰乱RNA运输，

药物：Vitravene

b、Decoy核酸

Decoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 .

体外筛选结合转录因子AP2的decoy核酸药物 ,结果OG03对多种肿瘤细胞生长有显著的抑制作用 ,在异植人肿瘤细胞NCI-H460的裸鼠模型中 ,静脉注射高中低三剂量组的decoy核酸OG03 ,抑瘤率分别达 71.8%、64.4 %及 57.3%.通过凝胶阻抑试验 ,验证了OG03与转录因子产生特异性结合 .实验结果为decoy核酸转录调控药物的研究提供了依据。

C、RNA干扰

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。

7、单克隆抗体药物

单克隆抗体(单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的抗体。起初用于诊断剂或检测剂，后来用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治疗肿瘤的优越性：

（1）单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用

（2）单抗药物具有更高的疗效

（3）单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用

其研究重点主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。目前，国

际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞，利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。

代表药物：曲妥珠单抗（trastuzumab， Herceptin ）

Trastuzumab为靶向结合HER2的人IgG1类单抗，HER2为酪氨酸激酶受体，在约20%～25%的进展期乳腺癌患者过表达。HER2分子具有以下的特点，因此成为乳腺癌治疗的靶分子：

①HER2的表达水平与乳腺癌的发病机理及预后相关；

②肿瘤的HER2表达水平及基因拷贝数远高于正常组织，有效的减轻了HER2靶向治疗药物的毒性；

③HER2表达阳性的肿瘤细胞比例很高，而且在肿瘤细胞表面高表达，因此在患者体内可以靶向大多数的肿瘤细胞；

④HER2在原发肿瘤及转移灶均有表达，因此HER2靶向治疗对原发及转移病灶均有效。

曲妥珠单抗（trastuzumab）的作用机制：

①抑制受体信号传导。HER2可以活化多种信号传导通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab减少了这些信号通路的传导，将细胞阻滞于调定点，诱导细胞凋亡。受体信号传导的降低是由于trastuzumab介导的HER2受体内化及降解。

②通过调节p27kipl阻滞细胞于G1调定点。Trastuzumab处理的细胞被阻滞于G1调定点，细胞增殖减少。细胞阻滞于G1调定点与细胞周期依赖的激酶抑制蛋白p27kipl相关。

③诱导细胞凋亡。体内研究表明trastuzumab可以诱导乳腺癌细胞凋亡，凋亡的发生与Ki67的表达无关。

④抑制血管形成。高表达HER2的肿瘤细胞新生血管及VEGF的表达显著增加。体内研究结果显示trastuzumab处理后，乳腺癌肿瘤体积减小，微血管密度降低；体外研究表明trastuzumab处理后，内皮细胞的迁移能力下降。

⑤ 抑制DNA修复。体外研究显示可与许多化疗药物产生协同效应。Trastuzumab或联合化疗药物促进DNA损伤，并抑制DNA的修复，最终导致细胞凋亡。

三、抗肿瘤药物筛选及评价

以国立肿瘤研究所（Nationai Cancel Institute NCI)为代表的美国抗肿瘤药物筛选模式经历了三个发展阶段。

• 1955-1985年，以动物移植性肿瘤为基本模型，以动物生命延长率和瘤重抑制率为药物活性的基本评价指标，此阶段是以化合物为本位的体内筛选方法。

• 1985-1990年，NCI提出并在广泛研究和试点的基础上逐渐完善以人肿瘤细胞株为基础、疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选模型。这阶段是新旧筛选模型并存，新的筛选体系逐渐取代旧筛选体系的过渡阶段。

• 1990-至今，以人肿瘤细胞株为基础、疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选体系，其目的在于发现对某种组织类型肿瘤活性强但可能对其他组织类型肿瘤活性弱的化合物。在该体系中，样品先经过9大类60种人类肿瘤细胞株进行体外筛选，结果通过评估后，再进行裸鼠体内的人类肿瘤异种移植研究。

国内抗肿瘤药物筛选和研究体系虽与NCI相似，但也形成了自己的特点。

❶根据我国肿瘤发病情况，选择试验瘤株组成，主要选择白血病、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等细胞株，相当一部分是细胞株是国内自己建的。

❷体外抗瘤谱试验选用了正常细胞株，综合考虑了受试样品对正常组织的毒性。

❸选用了人肿瘤耐药细胞株，测试受试样品的耐药逆转作用和耐药细胞株增殖的直接抑制作用，以期发现具有抗耐药作用的药物。

❹选用人血管内皮细胞株进行同步体外试验，初步考察受试样品是否具有血管生成抑制作用。

抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分

抗肿瘤药物药效学需研究内容：

体外抗肿瘤试验、体内抗肿瘤试验_x000B_

评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。

四、体外抗肿瘤活性试验

目的：

❶对候选化合物进行初步筛选；

❷了解候选化合物的抗瘤谱；

❸为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。

体外试验常用方法有：

1、染料排斥法

试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。

方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝

液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。

观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（IC50）作为药物抗肿瘤活性的指标。

2、四氮唑盐还原法

试验原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲[月替] (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。

方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于570nm波长处检测OD值。

观测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值×100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。

3、阿拉马蓝法

试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱

氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。

方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。

观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。

4、磺酰罗丹明染色法

试验原理：SRB是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。

方法要点： 用10%冷三氯乙酸与4℃固定已经受试样品处理的细胞1h，洗涤，干燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶标仪上与515nm波长处检测OD值。

观测指标 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、和T0。据此计算：

生长抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100% ；细胞死亡率（%）=（T—T0）/ T0 ×100% 。

按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出：

GI50，即生长抑制率为50%时的样品浓度；

TGI，即生长抑制率为100%时的样品浓度：

LC50，即细胞死亡率为50%时的样品浓度。

5、集落形成法

试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。

方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。

观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。

集落形成率=集落数/细胞接种数X100%

集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100%

6、生长曲线测定法

试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 。

方法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算。

观测指标 1、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 细胞生长饱和密度（N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。

药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照

a、体外筛选方法的优点：

❶操作简单；

❷用药量少；

❸取材可直接用于人体肿瘤；

❹得出结果快速；

b、体外筛选方法的缺陷：

❶细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故假阳性率高；

❷非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性；

❸体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞；

五、体内抗肿瘤活性试验

1、自发性肿瘤

2、诱发的肿瘤

3、移植性肿瘤

（a）皮下肿瘤模型

选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）×106。

（b）腹水瘤模型

无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）×106。

（c）原位接种模型

原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。

小鼠肿瘤模型 _x000B_淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各种小鼠肿瘤的亚型和耐药株等。

人癌裸小鼠移植瘤模型 _x000B_应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。

模型建立和使用应注意：

❶移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解；

❷ 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；

❸ 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型；

❹ 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于 15-20代 ；

给药方案和给药途径

分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。 可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。