海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交cDNA文库的构建

2021-06-09 来源：好走旅游网

江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),2006,22(2):113～116113

张大栋

1,2

,　马鸿翔,　吉晓佳,　周春霖,　王茂文,　汤日圣,　杨永华

123312

(1.江苏省农业科学院农业遗传生理研究所暨江苏省农业生物学重点实验室,江苏南京210014;2.南京大学医药生物技术

国家重点实验室,江苏南京210093;3.江苏沿海地区农业科学研究所,江苏盐城224002)

　　摘要:　为提高缩叶肉质盐生植物海蓬子总RNA和mRNA的质量,将改良CTAB法与Tripure试剂盒方法相结合,从300mg海蓬子发芽后20d的幼苗中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA。并以无NaCl处理为

Driver,以200mmol/LNaCl处理24h、48h、72h的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增,富集到

两组处理中差异表达的大小在200～1300bp的cDNA序列,pGEM2T的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重

组率分别达到2.6×10和96%,共收集阳性克隆12000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库。随机挑取酶

切质粒的电泳分析表明,载体中均有插入片段。两种RNA提取方法的结合有效提高了多汁多色素海蓬子RNA的质量,高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗盐基因奠定了基础。

关键词:　盐生植物海蓬子;抑制消减抑制杂交;

cDNA文库;

RNA分离

中图分类号:　Q785　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　100024440(2006)0220113204ConstructionofcDNALibraryofSalicorniabigeloviiTorr.duringEarlyStageofSaltStressBasedonSuppressionSubtractiveHybridization

ZHANGDa2dong

1,2

,　MAHong2xiang,　JIXiao2jia,　ZHOUChun2lin,　WANGMao2wen,　TANG

1233

Ri2sheng,　YANGYong2hua

(11InstituteofAgrobiologicalGeneticsandPhysiology,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China;21StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology,CollegeofLifeScience,NanjingUniversity,Nanjing210093,China;3.InstituteofAgriculturalSciencesinCoastalDistrictofJiangsu,Yanchen224002,China)

　　Abstract:　PuretotalRNAandmRNAweresuccessfullyisolatedfromsucculenthalophyte,Salicorniabigelovii

Torr.,usingacombiningmethodofmodifiedCTABandcommercialkit(Roche).FollowingthesynthesisofdoublecD2NA,suppressionsubtractivehybridization(SSH)wascarriedoutwiththemixedcDNAfrom202day2oldseedlingstreatedwith200mmol/LNaClfor24h,48h,and72has‘Tester’andthosetreatedwithoutNaClas‘Driver’.ThenaseriesofdifferentialcDNAssizedfrom200to1300bpwerepowerfullyenriched.ThelinkageofcDNAwithpGEM2Tvectorandwhite2bluescreeningindicatedthatthecontentoflibraryclonesandrecombinantratereached216×10and96%respec2tively.TheEcoRⅠdigestedofrandomrecombinantplastidsshowedthateachhadbeeninsertedbycDNAsequences.HighefficientconstructionofSSHcDNAlibrarypavedthewayforgeneexpressionanalysisanddiscoveryofnewgenescontribu2tingtosalttolerance.

Keywords:　halophyte;suppressionsubtractivehybridization;cDNAlibrary;RNAisolation

　　植物为适应盐渍、干旱等非生物胁迫会发生复

收稿日期:2005207225

基金项目:江苏省自然科学基金(BK2003201);江苏省农业科学院

基金(6110530)

作者简介:张大栋(19762),男,江苏徐州人,博士研究生,助理研究

员,主要从事植物分子生物学研究。

杂的生理生化变化,包括调节细胞的渗透和离子平衡以增加对水分的吸收;同时通过增加保护酶类如

超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等的表达以清除有毒

[1]

物质,这些变化都受到基因表达水平的调控。另一方面,植物的耐盐性是由多基因控制的数量性状,其多基因遗传和复杂的信号转导使培育真正的抗盐

114

[2,3]

江苏农业学报　2006年第22卷第2期

作物一直较为困难。不同于作物类甜土植物的天然盐生植物在长期的进化过程中形成了对土壤盐分的高度适应,可以在甜土植物无法生长的高盐土壤中正常生长发育,因此研究盐生植物盐胁迫下基因表达差异有利于进一步揭示植物在分子水平的抗盐机制。海蓬子作为典型的盐生植物,其最适生长环境的盐分高达200mmol/LNaCl,在此浓度下其各项生物学指标如分枝数、株高、种子数等均达到最

[4]

大值。

抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridiza2tion,SSH)技术是以抑制PCR为基础的DNA扣除杂交方法,其标准化步骤使TESTERcDNA单链的丰度进一步均等化,因此能使检测子和驱动子之间不同的序列得到最有效地扩增,成为研究不同环境下基因表

[5]

达差异最有效的方法。另外,缩叶肉质植物的RNA提取和纯化一直比较困难,而RNA的质量是抑制消减杂交技术也是其它一些分子生物学技术的关键步骤。本研究试图将改良CTAB法与Tripure试剂盒方法相结合,提取和纯化较高质量的海蓬子总RNA和mRNA,并在此基础上,进一步构建其盐胁迫初期的抑制消减杂交cDNA文库,以期为其后的基因差异表达分析及相关基因克隆打下基础。

[6]

μl,3个时性。将mRNA的终浓度调整到015μg/

间处理样品的mRNA经等量混合后用于抑制消减杂交。113　抑制消减杂交与cDNA文库构建

cDNA第一链和第二链的合成及抑制消减杂交

具体操作依照Clontech试剂盒PCR2SlectTMDNASubtractionKit进行,Tester双链cDNA经QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN)纯化和RsaⅠ消化后分成两部分,并分别连接粘端接头1和接头2。

接头1:5′2CTAATACGACTCACTATAGGGCTC2GAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′

　　　3′2GGCCCGTCCA25′接头2:5′2CTAATACGACTCACTATAGGGCA2GCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′

　　　3′2GCCGGCTCCA25′

两份Tester再分别与经RsaⅠ消化后双链DrivercDNA进行杂交。杂交产物混合后进行两次PCR扩增,第一次PCR扩增引物为:5′2CTAATAC2GACTCACTATAGGGC23′;第二次扩增引物为:5′2T2CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′和5′2AGCGTG2GTCGCGGCCGAGGT23′。反应体系均为24μl。

为了提高载体连接效率,消减杂交产物按QIA2GENPCR纯化试剂盒的方法进一步纯化,产物经纯化浓缩后与pGEM2T(Promega)载体连接,形成质

1　材料与方法

111　材料与处理

试验所用海蓬子种子,由江苏省农业科学院沿海地区农科所土壤肥料研究室提供。海蓬子种子在直径9cm培养皿中经Hoglang培养液培养20d后,用200mmol/LNaCl分别处理24h,48h和72h后收集整株海蓬子幼苗,液氮处理2min后-80℃保存,用作Tester材料;以无NaCl处理的清水对照海蓬子幼苗为Driver。每一时间处理的材料各取300mg鲜重组织。

112　总RNA提取与mRNA分离、纯化

在Tripure(Roche)试剂盒的提取液中加入终

粒文库。114　重组文库的滴度和酶切鉴定

将连接后载体的电转化宿主菌在37℃下培养20min,加入5ml融化的LB/MgSO4琼脂,混匀后倒

入37℃预热的LB/MgSO4平板上,冷却10min,37℃培养12h,计数噬菌斑和滴度。取2ml融化的上层琼脂,依次加入50μlIPTG/X2gal贮存液,计数蓝、白斑,计算重组效率。滴度(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释因子×[1000/稀

释的噬菌体铺板体积(μl)]

重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数)

从文库中随机挑8克隆,碱裂解法提取质粒,以EcoRⅠ酶、018%聚丙烯酰胺凝胶电泳观察插入片段效率。

浓度为1%的PVP和1%的β2巯基乙醇(生兴公司

产品),将300mg海蓬子整株幼苗经液氮研磨后置于65℃下20min,然后再按Tripure的方法完成提取总RNA的剩余步骤。按PolyATtractmRNAIsola2tionSystemⅢ(Promega)试剂盒操作方法从总RNA中分离、纯化mRNA,电泳检测总RNA质量,紫外分光光度计分析mRNA样品的浓度、纯度与完整

2　结果与分析

211　总RNA和mRNA分离

　　海蓬子为典型的缩叶肉质植物,幼苗中水分、多

张大栋等:海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交cDNA文库的构建115

糖和色素较多,造成了总RNA分离的困难,在单独使用Tripure(Roche)试剂盒的几次提取中,总RNA的质量均达不到下一步试验的要求。而高纯

[4]

理的mRNA经等量混匀后反转录形成双链TestercDNA,由无NaCl处理的mRNA反转录合成DrivercDNA,并用RsaⅠ进行单一酶切用于抑制消减杂

度的总RNA是开展SSH试验和其它植物分子生物学试验的前体和基础。为此,在本试验中,我们在Tripure试剂盒提取液中分别加入了终浓度为1%的PVP和β2巯基乙醇。同时为了能系统全面地了解差异基因表达的情况,试验材料选用Hogland培养的海蓬子整株幼苗,且来自NaCl处理后的24h、48h和72h。

018%琼脂糖电泳结果均显示有23S和18S带(图1),特别是A260/A280吸收值在118OD与211OD之间,表明几乎没有蛋白质及其它杂质的污

交,为了提高SSH杂交的效率和真实度,试验中又用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN)对cDNA进行了进一步纯化,018%琼脂糖凝胶电泳(图2)显示,其cDNA长度为500～2500bp,酶切产物长度范围也较广,为100～2000bp,满足了构建SSH杂交和cDNA文库对双链cDNA的要求。由酶切cD2NA进行抑制消减杂交,杂交产物经特异性引物进行两轮PCR扩增,形成均一化的差减cDNA序列。PCR差减产物的电泳结果表明其大小在200bp与1200bp之间(图3)。

染,相对于单独使用Tripure试剂盒和改良CTAT[7]

法提取的海蓬子总RNA的A260/A280为1106OD和1112OD,其纯度都有显著提高,且完全满足SSH试验的要求,RNA总提取率也达到了1g鲜组织112～116mg。Tripure为商用综合性提取试剂盒,其不仅用于植物也可广泛应用于动物和细胞组织的RNA提取,而相比之下植物组织中含有较多的色素或胶质化物质,为分离纯度较高的总RNA的带来了困难。PVP和β2巯基乙醇常用于CTAB法的植物总RNA的提取,其可以与多数色素类物质或含芳香环羟基的蛋白结合形成复合物,从而在分离

[6]

过程中尽量去除,本试验结果也进一步表明将Tripure与PVP及β2巯基乙醇结合使用可显著提高

RNA的纯度和提取率。Poly(A)RNA的A260/A280也均在1185OD以上,提取总量均在1μg以上。该方法是否适用于其它植物特别是多汁植物的RNA分离值得进一步验证。

1:标准DNA;2和4:Tester和DrivercDNA;3和5:Tester和DrivercDNARsaⅠ酶切产物。

1:Marker;2and4:cDNAofTesterandDriver;3and5:RsaⅠdi2gestionofthetwocDNAs.

图2　Driver和TestercDNA及其RsaⅠ酶切产物电泳鉴定图

Fig.2　ElectrophoresisofDriverandTestercDNAandtheirRsa

Ⅰdigestionproducts

　　经差减的cDNA文库与pGEM2T(Promega)载体连接,并电转化感受态细胞DH10B。将培养细胞涂于含Amp的LB/X2gal/IPTG培养基上筛选,挑取白

1.为对照;2～4分别为200mol/LNaCl处理后72h,48h,和24hRNA。

Lanes:1,Control;2—4,RNAaftertreatmentswith200mol/LNaClfor72h,48hand24hrespectively.

色阳性克隆共12000个,建立了质粒cDNA文库。

滴度试验结果表明,本试验构建的cDNA文库的滴度为216×10pfu/ml;经蓝白斑筛选测定结果显示,文库的重组率约为96%。

随机挑选了8个克隆进行EcoRⅠ酶切鉴定,结果表明,每个质粒均有插入片段,大小在300bp与

800bp之间(图4)。说明通过SSH技术已成功分离了两组材料中差异表达的基因序列。　　为适应长期的高盐环境,海蓬子在外部形态上

图1　海蓬子总RNA分离的电泳图

Fig.1　ElectrophoresisoftotalRNAisolatedfromSalicornia

bigeloviiTorr.

212　差减cDNA文库克隆和鉴定

　　来自200mmol/LNaCl处理后3个不同时间处

116江苏农业学报　2006年第22卷第2期

　　Ji等的研究结果表明,SSH不但能分离出在Tester中表达而在Driver中不表达的基因,还能分离出在Tester中表达是Driver中表达5倍以上的差

[9]

异表达的基因。1次SSH反应可以同时分离出成百个差异表达的基因,这一优点也使SSH远胜于其它差异表达基因的克隆技术。SSH虽然建立的时间不长,但已经在医学、微生物学等方面得到广泛和成功地应用。本试验在建立了更为有效的海蓬子RNA分离方法的基础上,将该技术用于海蓬子适应高盐环境的基因差异表达分析,成功构建了其质粒文库,对海蓬子幼苗胁迫初期(<72h)的整株幼苗进行基因表达差异的分析有利于进一步揭示其适应

1和3:标准DNA1和2;2:两轮PCR产物。

1and3:Marker1and2;2:Productsbytwo2roundPCRamplifica2tion.

高盐环境的分子机制,因而本试验结果为其后的基因表达谱分析及相关基因克隆打下了基础。参考文献:[1]　ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci,2001,6:

66～71.[2]　CushmanJC,BohnertHJ.Genomicapproachestoplantstresstol2

erance[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2000,3:117～124.[3]　林栖凤,赵可夫,李冠一,等.耐盐植物研究[M].北京:科学出

图3　差减产物套式PCR鉴定电泳图

Fig.3　ElectrophoresisanalysisofPCRproductsfromsuppres2

sionsubtractionhybridization

版社,2004.152.

[4]　AyalaF,O′learyJW.Growthandphysiologyofsalicorniabigelov2

iiTorr.atsuboptimalsalinity[J].

IntlJourofPlantSci,1995,

156:197～205.

[5]　JihuiZ,LouisEU,JosephDA.FormationofchimericcDNAsdur2

ingsuppressionsubtractivehybridizationandsubsequentpolymer2sasechainreaction[J].AnalyticalBiochemistry,2000,282:

M:标准DNA;1～8:质粒中插入的DNA片段。

M:Marker;1—8:DNAsequencesinsertedinrecombinantplastids.

259～262.

[6]　GehrigHH,WinterK,CushmanJ,etal.AnimprovedRNAiso2

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[7]　刘　志,杨永华.CTAB法提取中草药滇紫草细胞的总RNA

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[8]　ZhuJ.Geneticanalysisofplantsalttoleranceusingarabidopsis

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[9]　JiW,WrightMB,CaiL.EfficiencyofSSHPCRinisolatingdif2

ferentiallyexpressedgenes[J].BmcGenomics,2002,3:12.

PlantMolecularBiologyReporter,2000,

图4　重组质粒的EcoRⅠ酶切签定

Fig.4　ElectrophoresisofEcoRⅠdigestionofrecombinant

plastids

形成了缩叶肉质(Succulence)的特异结构;在细胞

和遗传水平上同其它植物的抗盐机制类似,通过清除活性氧、平衡离子和渗透作用来实现抗盐作用,但在抗盐能力上与甜土植物的巨大差异可能只表现在

[8]

细微的遗传差异之上。

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