低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响

园艺学报，2016，43 (3)：473–484. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0919；http：//www. ahs. ac. cn 473 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响 李荣坦1，姚华开1，刘岳飞1，杨尚东1,2,* （1广西大学农学院园艺系，南宁 530004；2广西农业科学院，广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007） 摘 要：以低磷胁迫和平衡施肥处理的番茄根系及根际土壤为研究对象，采用WinRHIZO根系分析系统、稀释平板法、PCR-DGGE等分析技术，研究低磷胁迫对番茄根系生长、根际土壤生物学特性以及细菌多样性的影响。结果表明：低磷胁迫导致番茄根系总根长、总根表面积、总根体积和根尖数减少；导致根际土壤中可培养微生物（细菌、真菌和放线菌）数量、酶活性、微生物生物量（C、N、P）以及细菌的多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度指数（Eh）等表征土壤肥力及健康状态的指标下降；导致部分诸如甲基杆菌属（Methylobacterium sp.）等具有溶磷功能的菌群缺失；平衡施肥对番茄的正常生长和提升土壤肥力以及维护土壤健康具有极其重要的作用。 关键词：番茄；低磷胁迫；根系；土壤细菌多样性；PCR-DGGE 中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0473-12 Effect of Low Phosphorus Stress on Root Growth and Soil Bacterial Diversity in Rhizosphere of Tomatoes LI Rong-tan1，YAO Hua-kai1，LIU Yue-fei1，and YANG Shang-dong1,2,* （1Department of Horticulture，Guangxi University，Nanning 530004，China；2Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China） Abstract：Based on the traditional and modern analyzed techniques，such as WinRHIZO root analysis system，dilution-plate method，PCR-DGGE etc.，the effect of low phosphorus stress on root growth，soil microbial properties and bacterial diversity under low phosphorus stress were analyzed. The results showed that the root length，surface area，volume and tip number were all decreased under low phosphorus stress. Additionally，soil microbial biomass，enzyme activities，microbial biomass（C，N，P）and soil bacterial diversity index（H），richness（S）and evenness index（Eh）were all also decreased under low phosphorus stress. However，some bacteria groups，such as Methyl bacterium（sp.），which have the function of soluble phosphorus，disappear in rhizosphere soil under low phosphorus stress condition. Moreover，it indicated that the degradation of soil fertility and soil bacterial community structure in rhizosphere were the main reason for the poor growth of tomatoes. The balance fertilization has an important function in improving the growth of tomatoes，soil fertility and health. 收稿日期：2015–12–30；修回日期：2016–03–04 基金项目：国家自然科学基金项目（31360506）；南宁市科学研究与技术开发计划项目（20132313）；广西农业科学院广西甘蔗遗传改良重点实验室开放课题（12-K-05-02） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ysd706@gxu.edu.cn） Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 474 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. Key words：tomato；low phosphorus stress；root；soil bacterial diversity；PCR-DGGE 番茄生长过程中缺磷会导致生长缓慢，早期叶片背面出现紫红色，茎细长，叶片小，开花结果期延迟等。由于缺磷直接影响番茄根系对土壤中氮的吸收，植株后期表现出卷叶现象（Kalaji et al.，2014）。番茄生产的限制因素很多，土壤缺磷是其中重要的障碍因子之一（Lynch & Brown，2008）。土壤溶液中游离的无机磷酸根在植物磷素营养循植物吸收磷素的化学形态主要是H2PO4-和HPO42-，环中起着重要作用（Pradhan & Sukla，2005）。在中国南方主要为酸性红壤，其铁、铝等含量较高，如果通过传统方法施用磷肥，磷极易被土壤固定达不到增加土壤有效磷的目的。研究表明，植物根系分布与磷的分布呈现较强的正相关性，植物根际土壤的pH值和肥料施用对磷的分布有显著影响（Vu et al.，2009）；植物响应低磷胁迫的差别主要表现在物种和基因上，而植物响应低磷胁迫主要方式是通过抑制主根内部细胞的分裂和分化来抑制主根的生长（Tyburski et al.，2012）。其次，在低磷条件下，植物根系将分泌一定量的有机酸和酸性磷酸酶，它能降解土壤中的有机磷，如核酸、磷脂和糖脂等，使有机磷转变为无机磷被吸收（Hoffland & Nelemans，1989）。在土壤生态系统物质分解循环利用中，微生物活动起着至关重要的作用。解磷微生物在土壤中普遍存在，它可以分泌有机酸和磷酸酶，使土壤中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物，从而为植物提供可吸收的无机磷（Khan et al.，2007）。20世纪50年代，解磷微生物作为生物有机肥已经被广泛应用到农业生产中，不仅能够增加作物磷素的吸收量，提高作物产量，还能大大提高磷肥的利用率，减少农业污染（Khan et al.，2013）。 前人关于低磷胁迫的研究主要局限于植物根系形态构型的改变，解磷微生物的分解功能和培育耐低磷品种等（Richardson & Simpson，2011），而对番茄根际土壤微生物群落结构影响的研究甚少。低磷条件下，化感水稻根际培养液中可培养的细菌、真菌数量明显高于正常磷素处理水平（陈良生，2011）。低磷胁迫如何影响番茄根际土壤微生物群落结构的变化尚不明确。根际是土壤—根系—微生物相互作用的微域，根际界面决定了氮磷养分的供应强度和有效性。针对根系—土壤和根系—微生物界面的养分活化和运输机制已有系统研究，但目前对土壤—根系—微生物之间在氮磷养分利用过程中的规律并不清楚（Philippot et al.，2013）。本试验旨在通过运用WinRHIZO根系分析系统、稀释平板法、PCR-DGGE等分析技术，研究低磷胁迫对番茄根系生长以及根际土壤生物学特性和微生物群落结构的影响，为进一步培育耐低磷番茄品种、发挥有益微生物的解磷功能及平衡施肥提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料与处理 番茄品种‘金玉11’、‘美国红冠’、‘红宝石1号’的种子均购于广西南宁市蔬菜种子市场。试全磷0.69 g · kg-1，全钾7.14 g · kg-1，碱解氮12.96 验中采用的土壤类型为赤红壤，全氮 0.48 g · kg-1，mg · kg-1，速效磷0.66 mg · kg-1，速效钾54.00 mg · kg-1，有机质8.56 g · kg-1，pH 5.65。根据中国第二次土壤普查制定的养分分级标准和土壤质量评价标准（全国土壤普查办公室，1998），试验采用的土壤符合试验要求。 试验采用盆栽（直径24 cm，高30 cm）的方法，于2015年在广西大学农学院蔬菜生产基地（东经108º18′，北纬22º51.2′）温室内进行。施肥处理根据赵斌等（2004）的施肥方案稍加改良。番茄李荣坦，姚华开，刘岳飞，杨尚东. 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响. 园艺学报，2016，43 (3)：473–484. 475 品种均设3个处理：（1）NK处理，不施P肥，只施N 120 mg · kg-1和K2O 230 mg · kg-1的低磷胁迫处理；（2）NPK处理，N 120 mg · kg-1、P2O5 110 mg · kg-1和K2O 230 mg · kg-1兼施的平衡施肥处理；（3）对照，既不种植番茄，也不施肥的处理。番茄品种内不同处理采用完全随机区组设计，每处理12盆，每盆1株，重复3次，每次重复108盆。番茄定植后进行搭架绑蔓、整枝打芽、除草灌溉、病虫害防治等常规管理。 1.2 样品采集及分析 1.2.1 样品采集 根系样品：番茄定植45 d后，用流水缓缓冲洗根系，在根系下面放置100目筛，收集被水流冲掉的根系。每个重复每个处理随机采集5株，分别进行根系指标测定，取5个数据的平均值进行方差和显著性分析。 根际土壤样品：番茄开花结果期，每个重复每个处理采用抖根法（Riley & Barber，1970）随机采集5 株番茄根际土壤，混合均匀后作为1份土壤样品，共27份土壤样品。剔除番茄残根等杂物后，用无菌塑料袋装好，带回实验室后，将每份土壤样品分为3部分：一部分室内自然风干后过40目筛，用于土壤理化性状测定；另一部分过10目筛后，置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物学性状分析；第3部分过10目筛后，将每个番茄品种每个处理的3个平行土壤样品混合均匀，得到7份土壤样品，置于–80 ℃冰箱保存，用于细菌群落结构分析。 1.2.2 根系形态分析 通过根系扫描仪（Founder Z2400）获得根系图像，经专用数字化软件（WinRHIZO Pro 2009c）分析后获得根长、根表面积、根体积和根尖数等形态指标（Wang & Qiang，2009）。根冠比（R / S，干质量比）测定采用烘干法（105 ℃杀青，70 ℃）。 1.2.3 土壤理化性状分析 土壤pH值采用PHS-3C型精密酸度计，有机质采用重铬酸钾容量法，全氮采用半微量凯氏法，全磷采用氢氧化钠碱熔融——钼锑抗比色法，全钾采用氢氧化钠熔融——火焰光度法，碱解性氮采速效钾采用1 mol · L-1 用碱解扩散法，速效磷采用0.5 mol · L-1 NaHCO3 浸提——钼蓝钼锑抗比色法，NH4OAc浸提——火焰光度法（鲍士旦，2011）测定。 1.2.4 土壤生物学性状分析 土壤可培养微生物数量测定采用稀释平板法（林先贵，2010），其中细菌培养采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌培养采用马丁氏琼脂培养基，放线菌培养采用改良高氏一号琼脂培养基。 土壤中C、N、P循环相关酶β–葡糖苷酶（β-glucosidase）活性测定采用Hayano（1973）的方法，氨肽酶（Aminopeptidases）活性测定采用Ladd（1972）的方法，磷酸酶（Phosphatase）活性测定采用Tabatabai和Bremner（1969）的方法。 微生物生物量碳测定采用氯仿熏蒸提取——容量分析法（Vance et al.，1987）；微生物生物量氮测定采用氯仿熏蒸提取——茚三酮比色法（Joergensen & Brookes，1990）；微生物生物量磷测定采用氯仿熏蒸提取——磷钼蓝比色法（吴金水 等，2003）。 1.2.5 土壤细菌群落结构分析 土壤微生物基因组总DNA提取参照Krsek和Welington（1999）的方法稍加改良：称取5.0 g土壤，加5.0 mL 0. 1 mol · L-1 pH 8.0磷酸缓冲液，加细微玻璃珠于室温下剧烈震荡10 min；加入25 mg溶菌酶，震荡5 min，37 ℃水浴锅中1 h；加500 µL 20% SDS，于恒温摇床震荡15 min（200 r · min-1，取上清液分装，每个1.5 mL离心管装1. 0 mL，加200 µL 8 mol · L-137 ℃），6 000 r · min-1离心10 min； Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 476 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. 乙酸钾，颠倒混匀1 min，12 000 r · min-1离心10 min；取1 mL上清液于2 mL离心管中，加等体积酚—氯仿—异戊醇抽提两次，混匀后12 000 r · min-1离心10 min；取上清液于1.5 mL离心管中，加入0.6倍体积冰冷的异丙醇，混匀后置于–20 ℃冰箱中沉降30 min，12 000 r · min-1离心10 min；倒掉离心管中的液体，加入1 mL的70%乙醇清洗两次；离心管中酒精挥发后，加35 µL TE溶解；采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（Sangon Biotech，产品号：SK8132）对DNA粗提液进行纯化。粗提和纯化结果均进行1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。纯化后的DNA样品用超微量分光光度计（IMPLEN，型号：P-330-31）检测，将符合试验要求的样品于–20 ℃冰箱保存备用。 土壤细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增采用降落PCR（Touchdown PCR）的方法。上游引物序列为GC-F338：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物为R518：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′（Lambais et al.，2008）。，dNTPs Mix 1 μL（10 mmol · L-1），PCR反应体系为：DNA模板 1 μL，10 × PCR Buffer 5 μL（Mg2+ plus），rTaq 酶 1 μL（5 U · μL-1），用灭菌去离子水补足至50 μL。上、下游引物各2 μL（10 μmol · L-1）PCR反应条件为：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，65 ~ 55 ℃（每个循环降低0.5 ℃）退火30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共20个循环；94 ℃ 变性 45 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共15个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 采用Bio-Rad公司DCodeTM基因突变检测系统（DCode Universal Mutation Detection System，Bio-Rad）对PCR反应产物进行分离。变性剂浓度30% ~ 60%（100%变性胶为7 mol · L-1尿素和40% 去离子甲酰胺的混合物）；PCR产物加样量40 μL；60 ℃，120 V的恒定电压条件下，电泳6 h。电泳完毕后银染20 ~ 30 min后用Bio-Rad公司GS-800TM Calibrated Densitometer观察并扫描成图像。 细菌16S rDNA片段的克隆和测序：切下目的条带，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒进行胶回收，以不含GC 片段的引物对F338和R518再次进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶中检测，将含有目的片段的PCR产物纯化后，与PMD18-T载体（Takara，产品号：K6701AA）连接进行克隆，将含有目的条带的菌液送上海生工测序。 测序结果于NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）进行序列同源性比对与分析。 1.2.6 数据处理 试验数据采用Excel 2010和SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计分析，平均数据以“平均数 ± 标准差（S.D.）”表示，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法（Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT）。使用Quantity one（V4.6.9）分析软件对DGGE图谱进行分析，多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（Eh）的计算参照马宁宁和李天来（2013）的方法进行。 2 结果与分析 2.1 低磷胁迫对番茄根系生长的影响 从表1可知，与平衡施肥相比，低磷胁迫处理的3个番茄品种的总根长、总跟表面积、总根体积和根尖数均不同程度的降低。3个番茄品种的总根长分别降低了65.1%、47.8%和66.6%，总根表面积分别降低了62.4%、31.9%和43.1%，总根体积分别降低了55.8%、19.8%和29.6%，根尖数分别降低了85.6%、66.8%和82.0%，而根冠比分别增加了18.1%、27.5%和26.3%。说明低磷胁迫导致番茄根系生长受到抑制。 李荣坦，姚华开，刘岳飞，杨尚东. 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响. 园艺学报，2016，43 (3)：473–484. 477 表1 低磷胁迫对不同番茄品种根系的响应 Table 1 Root response of different tomato cultivars under low phosphorus stress 施肥处理 Treatment NK NPK 美国红冠American Hongguan NK NPK 红宝石1号Hongbaoshi 1 NK NPK 品种 Cultivar 金玉11 Jinyu 11 总根长/cm Length 775.0 ± 41.8 b 2 222.4 ± 71.6 a 1 299.7 ± 63.7 b 2 491.9 ± 75.3 a 989.6 ± 73.2 b 2 961.9 ± 102.6 a总根表面积/cm2 Surf area 127.3 ± 8.5 b 338.4 ± 9.4 a 241.6 ± 6.6 b 354.7 ± 10.2 a 228.9 ± 12.2 b 402.4 ± 18.0 a 总根体积/cm3 Root volume 1.82 ± 0.13 b 4.12 ± 0.17 a 3.33 ± 0.19 b 4.15 ± 0.09 a 3.16 ± 0.34 b 4.49 ± 0.32 a 根尖数 Tip 1 572 ± 29 b 10 888 ± 438 a 3 402 ± 245 b 10 236 ± 328 a 2 695 ± 143 b 14 997 ± 1161 a 根冠比 Root/shoot ratio 0.1759 ± 0.0014 a 0.1489 ± 0.0018 b0.1782 ± 0.0058 a 0.1398 ± 0.0010 b0.1714 ± 0.0026 a 0.1357 ± 0.0011 b N：N 120 mg · kg-1；P：P2O5 110 mg · kg-1；K：K2O 230 mg · kg-1。同列中同一品种不同小写字母表示显著水平为0.05，下同。 N：N 120 mg · kg-1；P：P2O5 110 mg · kg-1；K：K2O 230 mg · kg-1. Values followed by different lowercase letters in the same row for the same variety are significantly different at 0.05 levels. The same below. 2.2 低磷胁迫对番茄根际土壤理化性状的影响 由表2可知，不同施肥处理对‘美国红冠’根际土壤中全氮含量的影响并不显著。与平衡施肥处理相比，低磷胁迫处理的‘红宝石1号’根际土壤中全氮含量降低了16.2%。与平衡施肥处理相比，低磷胁迫处理的‘金玉11’和‘红宝石1号’根际土壤中碱解氮含量分别增加了17.4%和49.6%。不同番茄品种根际土壤中全钾含量表现为：对照 > 低磷胁迫 > 平衡施肥，而速效钾含量却表现为低磷胁迫处理显著高于对照和平衡施肥处理，其中‘金玉11’根际土壤中速效钾含量最高，为对照的1.74倍。与平衡施肥相比，低磷胁迫处理的3个番茄品种根际土壤中全磷和速效磷含量显著性降低。3个番茄品种根际土壤全磷含量分别降低了13.5%、10.2%和11.2%，速效磷含量分别降低了70.2%、36.5%和81.0%。与平衡施肥相比，低磷胁迫处理的‘金玉11’和‘红宝石1号’根际土壤中有机质含量分别降低了43.5%和35.1%。同时，两种施肥模式均导致番茄根际土壤pH显著降低， 表2 低磷胁迫下番茄根际土壤理化性状 Table 2 Physical and chemical properties of soil under low phosphorus stress 品种 Cultivar – 金玉11 Jinyu 11 – 美国红冠American Hongguan – 红宝石1号Hongbaoshi 1 品种 Cultivar – 金玉11 Jinyu 11 – 美国红冠American Hongguan – 红宝石1号Hongbaoshi 1 施肥处理 Treatment 对照 Control NK NPK 对照Control NK NPK 对照Control NK NPK 施肥处理 Treatment 对照 Control NK NPK 对照Control NK NPK 对照Control NK NPK 全氮/（g · kg-1） Total N 0.87 ± 0.03 a 0.83 ± 0.02 ab 0.82 ± 0.03 b 0.87 ± 0.03 a 0.88 ± 0.01 a 0.87 ± 0.02 a 0.87 ± 0.03 b 0.79 ± 0.03 c 0.95 ± 0.03 a 碱解氮/（mg · kg-1）Available N 56.67 ± 3.06 b 63.00 ± 1.73 a 53.67 ± 2.08 b 56.67 ± 3.06 b 68.00 ± 1.73 a 68.33 ± 2.31 a 56.67 ± 3.06 a 55.33 ± 0.58 a 37.00 ± 4.00 b 全磷/（g · kg-1） Total P 0.54 ± 0.01 a 0.47 ± 0.01 b 0.54 ± 0.02 a 0.54 ± 0.01 a 0.50 ± 0.01 b 0.56 ± 0.01 a 0.54 ± 0.01 a 0.50 ± 0.01 b 0.56 ± 0.02 a 速效磷/（mg · kg-1）Available P 3.10 ± 0.20 b 1.50 ± 0.10 c 5.03 ± 0.12 a 3.10 ± 0.20 b 2.37 ± 0.23 c 5.30 ± 0.26 a 3.10 ± 0.20 b 1.37 ± 0.12 c 7.20 ± 0.20 a 全钾/（g · kg-1） Total K 15.36 ± 0.15 a 14.64 ± 0.12 b 12.55 ± 0.01 c 15.36 ± 0.15 a 14.95 ± 0.13 b 14.20 ± 0.15 c 15.36 ± 0.15 a 14.61 ± 0.15 b 13.95 ± 0.14 c 速效钾/（mg · kg-1） Available K 67.67 ±1.15 b 117.67 ±11.55 a 52.00 ± 0.50 c 67.67 ± 1.15 b 109.67 ± 1.15 a 61.00 ± 0.55 c 67.67 ± 1.15 c 105.00 ± 2.70 a 78.00 ± 1.50 b pH 5.64 ± 0.02 a 5.50 ± 0.01 c 5.61 ± 0.01 b 5.64 ± 0.02 a 5.46 ± 0.02 c 5.53 ± 0.01 b 5.64 ± 0.02 a 5.28 ± 0.04 c 5.36 ± 0.02 b 有机质/（g · kg-1）Organic matter 5.94 ± 0.39 b 3.81 ± 0.10 c 6.75 ± 0.17 a 5.94 ± 0.39 c 7.98 ± 0.16 a 6.94 ± 0.12 b 5.94 ± 0.39 b 4.94 ± 0.10 c 7.60 ± 0.20 a 注：–表示未种植，对照表示不施肥。下同。 Note：–means no planting. Control means no fertilization. The same below. Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 478 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. 尤其低磷胁迫处理对番茄根际土壤pH影响更显著；与对照相比，低磷胁迫处理的3个番茄品种根际土壤pH分别降低了2.5%、3.2%和5.0%。总体说，平衡施肥处理在不同程度水平提高了番茄根际土壤肥力。 2.3 低磷胁迫对番茄根际土壤生物学性状的影响 2.3.1 低磷胁迫对番茄根际土壤可培养微生物的影响 由表3可知，不同番茄品种根际土壤中可培养的细菌、真菌和放线菌数量均表现为：平衡施肥 > 低磷胁迫 > 对照。除‘红宝石’番茄品种外，低磷胁迫条件下番茄根际土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量均显著低于对应的平衡施肥处理。低磷胁迫处理条件下，‘红宝石1号’根际土壤中可培养细菌、放线菌数量最多，分别为对照的3.99倍和4.03倍，‘美国红冠’根际土壤中可培养真菌数量最多，为对照的2.99倍。 表3 低磷胁迫下根际土壤可培养微生物数量 Table 3 Numbers of microorganisms in the rhizosphere soil under low phosphorus stress 品种 Cultivar – 金玉11 Jinyu 11 – 美国红冠 American Hongguan – 红宝石1号 Hongbaoshi 1 施肥处理 Treatment 对照Control NK NKP 对照Control NK NKP 对照Control NK NKP 细菌/（106 CFU · g-1） Bacteria 10.11 ± 0.38 c 28.11 ± 0.95 b 35.53 ± 0.15 a 10.11 ± 0.38 c 29.29 ± 0.99 b 63.10 ± 0.19 a 10.11 ± 0.38 b 40.32 ± 0.30 a 42.73 ± 0.13 a 真菌/（104 CFU · g-1） Fungi 2.61 ± 0.24 c 6.15 ± 0.46 b 7.87 ± 0.82 a 2.61 ± 0.24 c 7.80 ± 0.43 b 12.81 ± 0.43 a 2.61 ± 0.24 b 5.86 ± 0.57 a 6.23 ± 0.30 a 放线菌/（106 CFU · g-1）Actinomycetes 6.34 ± 0.72 c 19.20 ± 2.08 b 29.27 ± 1.22 a 6.34 ± 0.72 c 17.22 ± 1.15 b 33.43 ± 0.98 a 6.34 ± 0.72 c 25.50 ± 1.22 b 29.79 ± 0.68 a 2.3.2 低磷胁迫对番茄根际土壤C、N、P循环相关酶活性的影响 由表4可知，不同施肥处理的3个番茄根际土壤中β–葡糖苷酶活性均表现为：平衡施肥 > 低磷胁迫 > 对照。平衡施肥处理的不同番茄品种均显著提高了氨肽酶的活性，分别为对照的1.11倍、1.10倍和1.11倍；低磷胁迫处理的‘美国红冠’根际土壤中氨肽酶活性与对照相比差异不显著。不同处理对3个番茄品种根际土壤中磷酸酶的活性影响趋势与β–葡糖苷酶相同。与平衡施肥处理相比，低磷胁迫处理的3个番茄品种根际土壤磷酸酶活性分别降低了50.4%、35.1%和54.5%。 表4 不同处理根际土壤相关酶活性 Table 4 Soil enzyme activity in the rhizosphere soil under low phosphorus stress 品种 Cultivar – 金玉11 Jinyu 11 – 美国红冠 American Hongguan – 红宝石1号 Hongbaoshi 1 施肥处理 Treatment 对照Control NK NKP 对照Control NK NKP 对照Control NK NKP β–葡萄糖苷酶/（nmol · g-1 · min-1）β-glucosidase 0.34 ± 0.15 c 1.86 ± 0.09 b 2.57 ± 0.01 a 0.34 ± 0.15 c 2.15 ± 0.03 b 2.74 ± 0.13 a 0.34 ± 0.15 c 1.94 ± 0.03 b 3.37 ± 0.03 a 氨肽酶/（nmol · g-1 · min-1）磷酸二酯酶（/nmol · g-1 · min-1）Aminopeptidase Phosphatase 15.58 ± 0.07 c 16.13 ± 0.18 b 17.26 ± 0.11 a 15.58 ± 0.07 b 15.40 ± 0.19 b 17.03 ± 0.21 a 15.58 ± 0.07 c 16.45 ± 0.19 b 17.28 ± 0.15 a 0.28 ± 0.09 c 0.66 ± 0.04 b 1.33 ± 0.02 a 0.28 ± 0.08 c 0.51 ± 0.03 b 0.79 ± 0.06 a 0.28 ± 0.08 c 0.48 ± 0.03 b 1.06 ± 0.04 a 2.3.3 低磷胁迫对番茄根际土壤微生物生物量C、N、P的影响 由表5可知，低磷胁迫下番茄根际土壤微生物生物量碳、氮和磷，虽然极显著高于对照土壤，李荣坦，姚华开，刘岳飞，杨尚东. 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响. 园艺学报，2016，43 (3)：473–484. 479 却极显著低于对应的平衡施肥处理。与平衡施肥相比，低磷胁迫处理的3个番茄品种根际土壤微生物生物量碳含量分别降低了36.2%、25.3%和25.2%；微生物生物量氮含量分别降低了55.3%，27.9%和11.0%；微生物生物量磷含量分别降低了45.0%、46.0%和26.0%。 表5 低磷胁迫对根际土壤微生物生物量的影响 Table 5 Effects of low phosphorus stress on microbial biomass C，N and P in rhizosphere soil 品种 Cultivar – 金玉11 Jinyu 11 – 美国红冠American Hongguan – 红宝石1号Hongbaoshi 1 施肥处理 Treatment 对照 Control NK NPK 对照Control NK NPK 对照Control NK NPK 生物量碳/（mg · kg-1） Microbial biomass C 35.99 ± 3.67 c 88.24 ± 6.95 b 138.37 ± 16.65 a 35.99 ± 3.67 c 115.43 ± 9.46 b 154.59 ± 12.36 a 35.99 ± 3.67 c 132.57 ± 7.06 b 177.19 ± 9.54 a 生物量氮/（mg · kg-1） Microbial biomass N 4.63 ± 0.15 c 7.31 ± 0.09 b 16.37 ± 0.24 a 4.63 ± 0.15 c 10.10 ± 0.34 b 14.01 ± 0.88 a 4.63 ± 0.15 c 8.30 ± 0.27 b 9.33 ± 0.07 a 生物量磷 /（mg · kg-1） Microbial biomass P 72.76 ± 2.4 c 123.68 ± 4.01 b 225.01 ± 1.29 a 72.76 ± 2.40 c 208.68 ± 7.50 b 386.70 ± 4.57 a 72.76 ± 2.40 c 321.74 ± 4.11 b 434.78 ± 4.17 a 2.4 低磷胁迫对番茄根际土壤细菌群落结构的影响 2.4.1 土壤细菌16S rDNA基因V3区PCR扩增 提取的土壤微生物总DNA为模板，GC-F338和R518为扩增引物，对16S rDNA V3可变区进行PCR扩增。如图1所示，16S rDNA扩增后的DNA片段长度为250 bp左右，特异性好，无杂带，与理论值相符，PCR扩增效果良好，扩增产物可以进行DGGE试验。 图1 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products 2.4.2 土壤细菌群落DGGE图谱分析 应用DGGE技术分离16S rDNA V3区片段PCR产物，可分离到数目不等、位置各异的电泳条带（图2）。整个DGGE图谱有56个带型，各泳道条带数为24 ~ 45条不等。其中对照泳道的条带数最少；平衡施肥处理下‘红宝石1号’泳道的条带数最多，且出现4条优势条带（4、5、6、7）。各泳道之间条带数和位置差异比较明显，个别条带在灰度值上也有一定的差异，且3个番茄品种低磷胁迫处理的泳道条带数比平衡施肥处理泳道条带数均有减少。与各处理泳道相比较，对照泳道的灰度明显偏低。1、4、5、7、9、10、11、16、17条带，虽然在每个泳道的灰度不同，但是所有处理共有条带；与对照相比，不同施肥处理下3个番茄根际土壤泳道都增加了2、3、6、13、14条带，这可能与番茄根系活动可以提高土壤微生物丰富度有关；8、12、15条带是3个番茄品种平衡施肥处理的特有条带（且对照中不存在），这些条带代表平衡施肥处理的特有细菌种群。 Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 480 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. 图2 低磷胁迫下番茄根际土壤细菌DGGE图谱 1 ~ 17为优势条带。 Fig. 2 DGGE profile of the soil bacteria in the rhizosphere soils under low phosphorus stress 1–17 are the major bands. 利用DGGE图谱数字化结果计算各处理根际土壤细菌多样性指数如表6所示，对照的细菌群落结构丰富度最低，多样性指数最小，但是均匀度最高；与平衡施肥处理相比，低磷胁迫导致3个番茄品种根际土壤细菌多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（Eh）均不同程度的降低。3个番茄品种根际土壤细菌多样性指数分别降低了3.4%、7.1%和11.2%，丰富度分别降低了10.8%、18.9%和28.9%，均匀度分别降低了0.1%、1.4%和2.4%。 表6 低磷胁迫下番茄根际土壤细菌多样性 Table 6 Diversity of soil bacterial communities in Rhizosphere under low phosphorus stress 品种 施肥处理 多样性指数（H） Cultivar Treatment Shannon diversity index – 对照Control 3.16 金玉11 NK 3.43 Jinyu 11 NPK 3.55 美国红冠 NK 3.26 American Hongguan NPK 3.51 红宝石1号 NK 3.33 Hongbaoshi 1 NPK 3.75 丰富度（S） Margalef richness index 24 33 37 30 37 32 45 均匀度（E） Pielou evenness index 0.996 0.981 0.982 0.958 0.972 0.960 0.984 2.4.3 细菌16S rDNA片段的序列分析 在DGGE分离后的条带中选取灰度值较高，且比较清晰可辨的条带进行切胶回收、重新PCR扩增和测序，获得17条测序结果（图2）。将17个序列于NCBI GenBank数据库中进行检索和同源性比对，选择与测序序列相似性最高的一条序列为参考对象，结果如表7所示。测序序列与已发表序列的相似度达到96% ~ 100%。有11个条带测序序列为不可培养的细菌，占到总序列数的65%，条带10和11测序序列与已发表的序列比对，最相似序列均属于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）的细菌。条带3、7、8、13、14和16测序序列比对结果分别与鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）、鞘脂单胞属（Sphingopyxis sp.）、甲基杆菌属（Methylobacterium sp.）、金黄杆菌属（Chryseobacterium 李荣坦，姚华开，刘岳飞，杨尚东. 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响. 园艺学报，2016，43 (3)：473–484. 481 sp.）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）和大肠杆菌属（Escherichia coli）相似度最高。 表7 部分条带16S rDNA PCR-DGGE片段测序分析结果 Table 7 Sequenced 16S rDNA fragments in different treatments of rhizosphere soil 条带 Band 序列长度/bp 最相似序列 Fragment length Strain of most identity sequence 推测类群 Putative phylum 相似度/% Identity 1 204 不可培养的细菌Uncultured bacterium（KF785170）2 199 不可培养的细菌Uncultured bacterium（JX647709）3 193 不可培养的鞘氨醇杆菌属 Uncultured Sphingobacterium sp.（JQ071856） 4 176 不可培养的细菌Uncultured bacterium（KF596604）5 192 不可培养的细菌Uncultured bacterium（LN572791）6 207 不可培养的细菌Uncultured bacterium（EU134061）7 211 鞘脂单胞属Sphingopyxis sp.（CP009452） 8 174 甲基杆菌属Methylobacterium sp.（KT757684） 9 198 不可培养的细菌Uncultured bacterium（KJ633686）10 211 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.（KT343857） 11 204 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.（NR132664） 12 177 不可培养的细菌Uncultured bacterium（JF325963） 96 鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium sp. 100 98 97 100 鞘脂单胞属Sphingopyxis sp. 甲基杆菌属Methylobacterium sp. 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp. 鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp. 100 100 100 99 100 98 99 13 194 金黄杆菌属Chryseobacterium sp.（HQ154575） 金黄杆菌属Chryseobacterium sp. 99 14 174 不可培养的红螺菌科细菌 红螺菌科Rhodospirillaceae 100 Uncultured Rhodospirillaceae bacterium（LN680487）15 177 不可培养的细菌Uncultured bacterium（LN736139）16 199 大肠杆菌Escherichia coli（CP011938） 17 199 不可培养的细菌Uncultured bacterium（KP156314）大肠杆菌Escherichia coli 100 100 99 3 讨论 植物根形态构型具有可塑性，植物可以通过调节自身形态、构型来适应外界环境条件（Tyburski et al.，2012）。在养分（如氮、磷）充足的土壤区域，根系生长快速，根系分支多（Hodge et al.，1999）；在土壤缺磷环境时，植物可以通过减少主根生长，促进侧根生长，以利于适应环境胁迫（Tyburski et al.，2012）。磷作为重要的营养元素显著影响植株的生长与代谢（Abel et al.，2002）。本研究中发现，低磷胁迫导致番茄根系长度、根表面积、根体积和根尖的数量显著下降，而且低磷胁迫对不同番茄品种根系生长影响程度不一致，这可能与不同番茄品种的耐低磷能力大小有关。此外，平衡施肥不仅具有促进根系生长，增大根系吸收面积与空间的作用，而且还促进了番茄地上部分的生长，使根冠比下降，这与前人的研究结果（Lynch & Brown，2001）一致。 低磷胁迫条件下，番茄植株根系分泌的有机酸和磷酸酶促进土壤磷素转化为可利用的磷，被吸收利用，导致根际土壤磷含量减少。低磷胁迫处理下番茄根系可以吸收的磷有限，直接抑制根系对氮、钾的吸收，表现为低磷胁迫处理的根际土壤中氮和钾的持有量显著高于对照和平衡施肥处理，番茄根系的生长也因营养供应不足受到抑制。这一结果与陈建国等（2011）研究平衡施肥对缺磷红壤水稻土肥力的影响结果类似。 土壤微生物种群的组成和数量变化可以反映土壤质量优劣和肥力水平（李秀英 等，2005）。土壤微生物数量受土壤养分含量、作物类型以及感病与否等理化及生态因素影响（杨尚东 等，2013）。除个别番茄品种外，低磷胁迫导致番茄根际土壤中可培养的细菌、真菌、放线菌数量显著低于平衡施肥处理。这一现象表明番茄根际土壤中可培养微生物数量不仅受土壤矿质元素含量的影响，而且还与品种间根系的生理活动强弱密切相关（王俊华 等，2015）。 土壤酶在土壤碳、氮、磷循环中发挥着重要的作用。土壤β–葡糖苷酶作为参与土壤中碳水化 Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 482 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. 合物水解的一类重要的酶，与土壤有机质的转化关系密切；氨肽酶能水解由氨基酸组成的肽和酰肽，为异养微生物提供所需氮源；磷酸酶则是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性（赵超 等，2010）。因此土壤酶活性是评价土壤健康和肥力水平的重要指标（Ahamadou et al.，2009）。土壤微生物生物量是植物矿质养分的源和汇，微生物生物量越大，土壤保肥作用越强，并使土壤养分趋于积累（Powlson et al.，1987）。本研究发现：低磷胁迫处理的番茄根际土壤中β–葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性，以及土壤微生物生物量均极显著低于对应的平衡施肥处理。陈波浪等（2014）研究发现施用磷肥可以显著增加土壤中磷酸酶的活性，王俊华等（2015）研究发现平衡施肥处理的土壤酶活性和土壤生物量碳、氮、磷含量显著高于缺磷施肥的处理。 PCR-DGGE技术是从微生物基因多样性角度研究微生物群落结构的方法。自从Muyzer等（1993）首次将这项技术应用于微生物生态学研究以来，已越来越多地将其用于研究微生物群落结构、多样性以及种群的动态变化（Sakurai et al.，2007；马宁宁和李天来，2013）。根据DGGE的分析原理，每1个条带大致与群落中的1个优势菌群或操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）相对应，DGGE 条带数量基本体现了微生物种群数量，而条带亮度则反映了该菌类数量的多少（Muyzer & Smalla，1998）。刘俊杰等（2008）研究发现，缺磷处理的大豆根际土壤中细菌多样性显著低于平衡施肥处理。由本试验DGGE图谱可以看出，与平衡施肥相比，低磷胁迫处理番茄根际土壤细菌多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度指数（Eh）均不同程度降低。进一步对不同施肥处理番茄根际土壤DGGE图谱中优势条带回收、克隆及测序发现：65%为不可培养细菌种属，如鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium sp.）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）等细菌属；同时亦有鞘脂单胞属（Sphingopyxis sp.）、甲基杆菌属（Methylobacterium sp.）、金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）以及大肠杆菌属（Escherichia coli）等可培养细菌种属。研究表明：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）、金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）与大肠杆菌属（Escherichia coli）属于有溶磷功能的细菌种属（Chen et al.，2006；黄腾，2009；Ahemad，2014）。这一结果表明：低磷胁迫条件下，番茄根际土壤中虽然富集了部分具有溶磷功能的细菌种属，但同时亦会导致部分诸如甲基杆菌属（Methylobacterium sp.）等具有溶磷功能的细菌种属缺失。究其原因，还需进一步研究。 References Abel S，Ticconi C A，Delatorre C A. 2002. Phosphate sensing in higher plants. Physiologia Plantarum，115 (1)：1–8. Ahamadou B，Huang Q，Chen W，Wen S，Zhang J，Mohamed I，Cai P，Liang W. 2009. Microcalorimetric assessment of microbial activity in long-term fertilization experimental soils of Southern China. Fems Microbiology Ecology，70 (2)：186–195. Ahemad M. 2014. Phosphate-solubilizing bacteria-assisted phytoremediation of metalliferous soils：A review. Biotech，5 (2)：11. Bao Shi-dan. 2011. Soil chemical analysis. Beijing：China Agriculture Press：25–114. (in Chinese) 鲍士旦. 2011. 土壤农化分析. 北京：中国农业出版社：25–114. Chen Bo-lang，Jiang Ping-an，Sheng Jian-dong. 2014. Effect of phosphate fertilizers on soil available phosphorus and soil enzyme activities in cotton field. Chinese Journal of Soil Science，(1)：185–188. (in Chinese) 陈波浪，蒋平安，盛建东. 2014. 磷肥对棉田土壤有效磷及土壤酶活性的影响. 土壤通报，(1)：185–188. Chen Jian-guo，Zhang Yang-zhu，Zeng Xi-bai，Tan Zhou-jin，Zhou Qing. 2011. Ecological effects of balanced fertilization on red earth paddy soil with P-deficiency. Acta Ecologica Sinica，31 (7)：1877–1887. (in Chinese) 陈建国，张杨珠，曾希柏，谭周进，周 清. 2011. 平衡施肥对缺磷红壤性水稻土的生态效应. 生态学报，31 (7)：1877–1887. Chen Liang-sheng. 2011. Impact of lower phosphorus supplies on rhizospheric microbial diversity of different allelopathic rice[M. D. Dissertation]. 李荣坦，姚华开，刘岳飞，杨尚东. 低磷胁迫对番茄根系生长及根际土壤细菌多样性的影响. 园艺学报，2016，43 (3)：473–484. 483 Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University. (in Chinese) 陈良生. 2011. 低磷对化感水稻根际微生物多样性的影响[硕士论文]. 福州：福建农林大学. Chen Y P，Rekha P D，Arun A B，Shen F T，Lai W A，Young C C. 2006. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied Soil Ecology，34：33–41. Hayano K. 1973. A method for the determination of β-glucosidase activity in soil. Soil Science & Plant Nutrition，19 (2)：103–108. Hodge A D，Griffiths B S，Fitter A H. 1999. Why plants bother: root proliferation results in increased nitrogen capture from an organic patch when two grasses compete. Plant，22 (7)：811–820. Hoffland E，Nelemans J A. 1989. Solubilization of rock phosphate by rape：II. Local root exudation of organic acids as a response to P-starvation. Plant & Soil，113 (2)：161–165. Huang Teng. 2009. Study on selection and synergism of efficient phosphorous-solubilizing bacteria [M. D. Dissertation]. Wuhan：Wuhan University of Technology. (in Chinese) 黄 腾. 2009. 溶磷菌株选育及菌群协同作用研究[硕士论文]. 武汉：武汉理工大学. Joergensen R G，Brookes P C. 1990. Ninhydrin-reactive nitrogen measurements of microbial biomass in 0.5 M K2SO4 soil extracts. Soil Biology & Biochemistry，22：1023–1027. Kalaji H M，Oukarroum A，Alexandrov V，Kouzmanovac M，Bresticd M，Zivcakd MSamborskaa I A，Cetnera M D，Allakhverdiev S I. 2014. Identification of nutrient deficiency in maize and tomato plants by in vivo chlorophyll a fluorescence measurements. Plant Physiology & Biochemistry，81 (81)：16–25. Khan M S，Ahmad E，Zaidi A，Oves M．2013. Functional aspect of phosphate-solubilizing bacteria：Importance in crop production. Bacteria in agrobiology：crop productivity. Springer Berlin Heidelberg，1：237–263. Khan M S，Zaidi A，Wani P A. 2007. Role of phosphate solubilizing microorganisms in sustainable agriculture：A review. Agronomy for Sustainable Development，27 (1)：29–43. Krsek M，Welington E M. 1999. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil. Journal of Microbiological Methods，39 (1)：1–16. Ladd J N. 1972. Properties of proteolytic enzymes extracted from soil. Soil Biology & Biochemistry，4(2)：227–237. Lambais M R，Otero X L，Cury J C. 2008. Bacterial communities and biogeochemical transformations of iron and sulfur in a high saltmarsh soil profile. Soil Biology & Biochemistry，40 (11)：2854–2864. Li Xiu-ying，Zhao Bing-qiang，Li Xu-hua，Li Yan-ting，Sun Rui-lian，Zhu Lu-sheng，Xu Jing，Wang Li-xia，Li Xiao-ping，Zhang Fu-dao. 2005. Effects of different fertilization systems on soil microbe and its relation to soil fertility. Scientia Agricultura Sinica，38 (8)：1591–1599. (in Chinese) 李秀英，赵秉强，李絮花，李燕婷，孙瑞莲，朱鲁生，徐 晶，王丽霞，李小平，张夫道. 2005. 不同施肥制度对土壤微生物的影响及其与土壤肥力的关系. 中国农业科学，38 (8)：1591–1599. Lin Xian-gui. 2010. Principle and methods of soil microbiology research. Beijing：China Agriculture Press：24–85. (in Chinese) 林先贵. 2010. 土壤微生物研究原则与方法. 北京：中国农业出出版社：24–85. Liu Jun-jie，Wang Guang-hua，Jin Jian，Liu Ju-dong，Zhang Qiu-ying，Liu Xiao-bing. 2008. Effect of different phosphorus concentrations on microbial communities in soybean rhizosphere. Soybean Science，27 (5)：801–805. (in Chinese) 刘俊杰，王光华，金 剑，刘居东，张秋英，刘晓冰. 2008. 磷浓度处理对大豆根际土壤微生物群落结构的影响. 大豆科学，27 (5)：801–805. Lynch J P，Brown K M. 2001. Topsoil foraging–an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant & Soil，237 (2)：225–237. Lynch J P，Brown K M. 2008. Root strategies for phosphorus acquisition. Plant Ecophysiology，7：83–116. Ma Ning-ning，Li Tian-lai. 2013. Effect of long-term continuous cropping of protected tomato on soil microbial community structure and diversity. Acta Horticulturae Sinica，40 (2)：255–264. (in Chinese) 马宁宁，李天来. 2013. 设施番茄长期连作土壤微生物群落结构及多样性分析. 园艺学报，40 (2)：255–264. Muyzer G，Smalla K. 1998. Application of denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and temperature gradient gel electrophoresis（TGGE） Li Rong-tan，Yao Hua-kai，Liu Yue-fei，Yang Shang-dong. Effect of low phosphorus stress on root growth and soil bacterial diversity in rhizosphere of tomatoes. 484 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：473–484. in microbial ecology. Antonie Van Leeuwenhoek Int. J. Gen. Mol. Antonie Van Leeuwenhoek，73 (1)：127–141. Muyzer G，Wall E C D，Uitterlinden A G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rDNA. Applied & Environmental Microbiology，59 (3)：695–700. National Soil Survey Office. 1998. Chinese soil. Beijing：China Agriculture Press：1015–1016. (in Chinese) 全国土壤普查办公室. 1998. 中国土壤. 北京：中国农业出版社：1015–1016. Philippot L，Raaijmakers J M，Lemanceau P，van der Putten W H. 2013. Going back to the roots：the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology，11 (11)：789–799. Powlson D S，Prookes P C，Christensen B T. 1987. Measurement of soil microbial biomass provides an early indication of changes in total soil organic matter due to straw incorporation. Soil Biology & Biochemistry，19 (2)：159–164. Pradhan N，Sukla L B. 2005. Solubilization of inorganic phosphate by fungi isolated from agriculture soil. African Journal of Biotechnology，5 (10)：850–854. Richardson A E，Simpson R J. 2011. Soil microorganisms mediating phosphorus availability. Plant Physiology，156 (3)：989–996. Riley D，Barber S A. 1970. Salt accumulation at the soybean[Glycine max（L.）Merr]root-soil interface. Proceedings Soil Science Society of America，34 (1)：154–155. Sakurai M，Suzuki K.，Onodera M，ShinanoT，Osaki M. 2007. Analysis of bacterial communities in soil by PCR-DGGE targeting protease genes. Soil Biology & Biochemistry，39 (11)：2777–2784. Tabatabai M A，Bremner J M. 1969. Use of P-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil Biology & Biochemistry，1 (4)：301–307. Tyburski J，Dunajska-Ordak K，Skorupa M，Tretyn A. 2012. Role of ascorbate in the regulation of the Arabidopsis thaliana root growth by phosphate availability. Journal of Botany，2012：1–11. Vance E D，Brookes P C，Jenkinson D S. 1987. An extraction method for measuring soil microbial biomass C. Soil Biology & Biochemistry，19 (6)：703–707. Vu D T，Tang C，Armstrong R D. 2009. Tillage system affects phosphorus form and depth distribution in three contrasting Victorian soils. Australian Journal of Soil Research，47：33–45. Wang Jun-hua，Hu Jun-li，Lin Xian-gui，Yin Rui，Dai Jue，Zhang Hua-yong，Qin Sheng-wu. 2015. Effects of long-term different fertilization on soil microbial properties and crop nutrient uptake//Proceedings of the Eighth National Symposium on Soil Biology and Biochemistry and the Third National Symposium on Soil Health：28–29. (in Chinese) 王俊华，胡君利，林先贵，尹 睿，戴 珏，张华勇，钦绳武. 2015. 长期不同施肥对潮土微生物学性状和作物养分吸收的影响//第八次全国土壤生物与生物化学学术研讨会暨第三次全国土壤健康学术研讨会论文摘要集：28–29. Wang M B，Qiang Z. 2009. Issues in using the WinRHIZO system to determine physical characteristics of plant fine roots. Acta Ecologica Sinica，29 (2)：136–138. Wu Jin-shui，Xiao He-ai，Chen Gui-qiu，Huang Min. 2003. Measurement of microbial biomass-P in upland soils in China. Acta Pedologica Sinica，40 (1)：70–78. (in Chinese) 吴金水，肖和艾，陈桂秋，黄 敏. 2003. 旱地土壤微生物磷测定方法研究. 土壤学报，40 (1)：70–78. Yang Shang-dong，Wu Jun，Zhao Jiu-cheng，Guo Yi-juan，Long Ming-hua. 2013. Comparative studies on chemical and biological characteristics of rhizosphere soils between infected plants of tomato bacterial wilt and its non-infected plants. China Vegetables，(22)：64–69. (in Chinese) 杨尚东，吴 俊，赵久成，郭伊娟，龙明华. 2013. 番茄青枯病罹病植株和健康植株根际土壤理化性状及生物学特性的比较. 中国蔬菜，(22)：64–69. Zhao Bin，Lang Jia-qing，Han Xiao-ri，Yang Jin-feng，Zheng Guo-di. 2004. Study on the optimum fertilizer rate and proportion of tomato. Liaoning Agricultural Sciences，(5)：16–18. (in Chinese) 赵 斌，郎家庆，韩晓日，杨劲峰，郑国砥. 2004. 番茄最佳施肥量及配比研究. 辽宁农业科学，(5)：16–18. Zhao Chao，Wang Bing，Dai Wei，Wu Yong-ling. 2010. The relationship between soil enzyme activities and soil physicochemical properties in Moso bamboo forest soil at different altitudes. Hebei Journal of Forestry and Orchard Research，25 (1)：1–6. (in Chinese) 赵 超，王 兵，戴 伟，吴永玲. 2010. 不同海拔毛竹土壤酶活性与土壤理化性质关系的研究. 河北林果研究，25 (1)：1–6.