在拟南芥中一种胞间连丝相关的β-1,3葡聚糖酶

在拟南芥中一种胞间连丝相关的β-1,3葡聚糖酶

摘要

胞间连丝的通透性是被植物体中胼脂质的动态平衡所调控的，而其又依赖于合成酶的活性。通过蛋白质组学分析，在拟南芥的胞间连丝相关蛋白富集片段中发现了一种β-1,3葡聚糖酶，这个蛋白被一个假定的ATBG（putative plasmodesmal associated protein (ppap) gene, termed AtBG_ppap,）基因所编码。而且还发现该蛋白是一种转录后期的修饰过的糖基磷脂酰肌醇类，我们将其与GFP融合之后在烟草表皮中表达，发现该蛋白定位于内质网与细胞壁，并且在细胞壁当中成对出现。在其突变体当中，转基因之后发现GFP的移动速度明显慢于野生型，GFP在细胞间的传递速度变慢可能与胞间连丝的通透性有关，在对突变体进行胁迫之后发现体内积累的胼脂质要明显高于野生型，因此我们推断该基因可能编码一种β-1,3葡聚糖酶，对于胼脂质的降解是非常重要的，并且定位于胞间连丝，对于胞间连丝通透性的改变起着很大的作用。

前言

胞间连丝（Pd）是植物相邻细胞中一种穿越细胞壁的一种共轴的膜通道，将两个细胞的细胞质连通，从而来进行一些信息的传递和物质的交换，这对于植物的正常发育是非常必须的。

尽管胞间连丝的超微结构已经描述的很好，但是其分子组成仍然还有很多是未知的，文献中报道过，其通透性收到Ca2+和细胞骨架蛋白的调节。在胞间连丝的两端分别有一个颈区，胼脂质可以再此积累，并且胼脂质再次的分解与合成对于胞间连丝的通透性有着很强的调控作用。

目前关于胞间连丝通透性的控制因素，主要有两种比较重要的理论，第一种就是，胞间连丝的通透性是受到骨架蛋白的调控，因为在其结构中有很多相关蛋白，而且通过实验发现，用细胞骨架的相关蛋白处理之后发现，胞间连丝飞分子排阻限度即通透性有所改变。第二种是，环绕胞间连丝的细胞壁的细胞壁鞘结构发生变化引起的，因为在该部位有胼脂质的动态平衡，当胼脂质较多时，使颈口变窄，降低通透性，反之亦然。胼脂质的动态平衡对于胞间连丝的通透能力有很大影响。

结果

1.蛋白质组学研究揭示了一种潜在的胞间连丝相关的β-1,3葡聚糖酶

首先，将胞间连丝相关蛋白的富集蛋白。进行琼脂糖凝胶电泳，然后每条带进行回收纯化，然后做一个MS。对其序列进行分析，发现在肩头所指位置，其序列与生物软件分析的At5g42100序列完全吻合，推测其可能是胞间连丝的相关蛋白。

图二为该基因的简图，之后的转基因均采用左边的基因片段（效果较好），该片段是将内含子切掉，并且有GPI的锚定位点和GFP的插入位点。

图三为对该基因在不同组织中做的半定量，可以看出，该基因在花和果荚以及茎中较多

2.AtBG_ppap:GFP这个融合蛋白定位于胞间连丝

图中A图为烟草叶表皮细胞的瞬时表达，可以看到绿色荧光主要定位于两个细胞相接

的地方，BCD图均为转基因烟草的表皮细胞可以清楚的看到荧光成对的分布于两细胞之间的细胞壁上。

并且发现，GFP的荧光位点与苯胺蓝着色的胼脂质是共定位的，可见该蛋白是定位于胞间连丝上并且可能与胼脂质存在一定的关系。

3. AtBG_ppap:GFP是一种膜定位的蛋白

A图是瞬时表达的烟草的表皮细胞可以发现荧光存在于膜结构上的，之后在进行质壁分离之后，细胞壁与细胞膜分开之后，用膜maker染之后发现，红色的FM4-64与绿色荧光是共定位的。从而确定该蛋白是定位于细胞膜上而不是细胞壁上。

4.在转基因烟草当中发现GFP在细胞间的传递速度有所减少

上图为购买的两个突变体，两个突变体均是该基因的功能确实已经缺失。在应该出现条带的地方两个突变体均没有条带，之后作者就在假定β-1,3葡聚糖合酶活性稳定的前提之下还讨论β-1,3葡聚糖酶的缺失对植物的影响。

上图为，在烟草表皮细胞，用基因枪的方法将融合基因片段在其内瞬时表达，并在相

同的时间内，观察GFP从起始注射细胞的扩散情况，图中可以看出，相同的时间之内，野生型（d）的有GFP存在的喜报个数要远远多于两个突变体，从而可以看出，该突变体当中，GFP在细胞间的传递速度有所减慢。

为了进一步证明，该基因的缺失与胼脂质之间的关系，作者用突变体和野生型分别用胁迫处理，然后用苯胺蓝来染胼脂质，观察胼脂质的积累情况，因为在胁迫条件下植物会合成较多的胼脂质来抵御胁迫。（a）为突变体可以发现其中着色的点要远多于（b）野生型当中，从而得出结论，由于该基因的缺失，导致了胼脂质的大量累积。

讨论

该蛋白首先定位与胞间连丝，并且荧光显示成对存在，这与胼脂质在胞间连丝的定位是吻合的，并且之后的与胼脂质染色的共定位也说明了这个问题，所以笔者猜测，该蛋白与胼脂质有着密切的关系，推断为降解胼脂质的酶即β-1,3葡聚糖酶，正是因为该基因功能的缺失导致了植物在讲解胼脂质的过程当中存在缺陷，从而导致胼脂质的积累，胼脂质的积累又会直接影响胞间连丝的颈区结构，从而来影响胞间连丝的通透性.。