猪源沙门氏杆菌分离与鉴定

作者：尉玉杰

来源：《畜牧兽医科学》2019年第24期

摘要：从猪的粪便中分离出引起仔猪副伤寒的病原菌，对该病原菌的菌落特征和生化特点进行了鉴定分析，并对该病原菌进行了体外抑菌试验，结果显示该种致病菌对头孢塞芬、头孢唑啉敏感性最强，抑菌圈分别是18、25mm，在猪源沙门氏菌防治中，应该选择上述2种抗生素进行对症治疗，这样才能提高治疗效果。 关键词：猪源沙门氏菌;分离鉴定;体外抑菌试验 中图分类号：S852.61 文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.24.005 0引言

沙门氏菌在自然界中广泛分布，是牲畜体内的一种常在菌群，广泛存在于猪牛羊的肠道中，通常沙门氏菌不会表现出明显的致病能力，只有当动物身体抵抗能力下降、胃肠道中的有益菌群失衡时，沙门氏菌才会表现出致病能力，导致猪出现典型的临床症状。 1材料与方法 1.1材料选取

本次研究所采集到的病例主要来源于某中小规模养殖场养殖的患病猪。在无菌条件下，直肠深部采集患病猪的新鲜粪便装人到无菌保存袋后，带回试验室保存，在4C环境下等待使用。本次研究中所使用的培养基主要包括黄绿磺胺培养基、普通营养培养基、三糖铁培养基、明胶液化培养基和柠檬酸盐培养剂。上述几种培养基按照相应的配置方法严格制作。试验中使用的试剂主要包括结晶紫、卢格氏碘液、番红染色液、甲基红指示剂。 1.2方法

1.2.1细菌分离培养

将采集到的粪便制作成涂片后，选择使用革兰氏染色剂对涂片进行充分染色，结合染色结果判定是否为沙门氏菌，再决定是否需要进行细菌分离培养。在细菌分离培养中，先进行增

菌培养，培养一段时间后，将增菌液划线接种到分离培养基上，然后挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，如果是红色短棒杆菌[1]，需要进行进一步纯化培养，重复上述步骤，直到显微镜检查的致病菌形态一致为止。 1.2.2细菌形态鉴定

首先，革兰氏染色。将采集到的病料，涂抹在载玻片上，使用结晶紫对涂片进行充分染色，染色时间控制在1min。染色结束后用水小心冲洗，然后进行媒染，向涂片滴加革兰氏碘液，作用1min后，用清水将碘液去除，再将载玻片倾斜，向其中连续滴加95%的乙醇，脱色20～25s，直到流出的液体无色为止，然后使用清水立即清洗干净[2]。选择使用番红复染，将染好的涂片放置在空气中晾干或者使用吸水纸吸干;显微镜检查。从培养基上选择典型形态的单个致病菌菌落，小心挑取致病菌，制成涂片后进行革兰氏染色，然后放置在显微镜下观察，致病菌被革兰氏染.成紫色表示革兰氏阳性染色，若染成红色表示为革兰氏阴性染色。 1.2.3致病菌生化鉴定

将革兰氏阴性染色的杆菌进行各种发酵糖发酵试验，再进行进一步的生化鉴定。生化试验主要选择过氧化氢试验、柠檬酸盐试验、产硫化氢试验、明胶液化试验、乙酰甲基醇试验、苯丙氨酸试验。结合最终试验结果确定相应的细菌种类。 1.2.4药敏试验

选择使用纸片扩散法，将培养好的致病菌涂布在培养皿上，将各种药名纸片做好标记后，放置在培养皿中，持续培养24h后，观察抑菌圈大小，用抑菌圈的大小表示该种抗生素对致病菌的敏感程度。 2结果 2.1致病菌形态

致病菌能在黄绿磺胺培养基上生长，生长出圆形、表面湿润光滑、边缘整齐、淡黄色透明的致病菌菌落，菌落中央突起。同时，在细菌培养中发现培养基颜色由红色逐渐变成淡黄色。进一步镜检可以发现致病菌呈杆状，两端呈椭圆形，革兰氏阴性染色。进一步分离培养，发现分离出的沙门氏菌菌落直径为0.5～1.5mm，中央凸起，圆形，边缘整齐，呈淡黄色，湿润光滑，细菌有鞭毛能运动，没有芽孢，没有夹膜[3]。 2.2生化鉴定

对从患病猪粪便中分离出来的致病菌进行生化鉴定，发现该种致病菌过氧化氢酶试验为阳性，柠檬酸盐试验、产硫化氢试验、明胶液化试验、乙酰甲基醇试验、苯丙氨酸试验全部为

阴性。结合上述致病菌培养的形态特征和生化鉴定，结果可以判定分离出来的细菌属于沙门氏菌属。将分离出来的致病菌进行进一步的糖发酵试验，结果显示分离得到的致病菌能发酵葡萄糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、麦芽糖，不能发酵乳糖和蔗糖，结合常见细菌系统鉴定手册，对该细菌种类进行鉴定，可知分离得到的沙门氏菌属于甲型副伤寒沙门氏菌。 2.3药敏试验

将分离得到的致病菌分别与头孢唑林、头孢塞酚、万古霉素、红霉素、氯霉素、青霉素、四环素、苯唑西林、甲氧氟啶、诺氟沙星进行纸片扩散法药敏试验。在药敏试验判定中，如果抑菌圈的大小超过15mm，则判定该种抗生素对沙门氏菌高度敏感，具有强抑菌作用。如果抑菌圈的直径大于10mm、小于15mm，则表示该种抗生素对致病菌具有中度抑菌作用。如果抑菌圈的直径小于10mm，表示该种抗生素对沙门氏菌的抑菌作用较低。如果抑菌圈直径小于5mm，表示该种致病菌对该种抗生素具有耐药性。通过药敏试验发现头孢唑林、头孢塞酚、万古霉素、红霉素、氯霉素、青霉素、四环素、苯唑西林、甲氧氟啶、诺氟沙星的抑菌圈直径分别为18、25、7、7、8、7、9、13、10、3mm，结合，上述判定要求，发现分离得到的致病菌对头孢唑林、头孢塞酚高敏，对苯唑西林、甲氧氟啶中敏，对四环素、红霉素、氯霉素、青霉素、万古霉素低敏，对诺氟沙星耐药。 3讨论与结论

3.1合理选择分离培养基

沙门氏菌在不同生长环境下所需要的培养基种类存在很大差异性，因此应该根据沙门氏菌所处的生长环境与不同培养基的生长情况进行综合选择。在进行沙门氏菌分离培养中，常规的方法是选择麦康凯琼脂培养基、sS琼脂培养基、伊红美蓝琼脂营养培养基。其中在SS琼脂培养基上生长的致病菌无色透明，中间带有黑色的金属光泽感;在麦康凯琼脂培养基上能生长出无色透明的致病菌菌落，能与大肠杆菌作出区分。本次所选择的培养基中，致病菌在黄绿磺胺培养基中生长，会使培养基的颜色由红色变成淡黄色，顏色变化较为明显，同时分离出的致病菌形态更为明显，能更加明显地鉴定沙门氏菌属性。 3.2细菌分离鉴定

沙门氏菌在分离鉴定中常规的方法是根据致病菌的形态以及生化试验确定致病菌类型，同时也可以借助分子生物学，如血清鉴定、PCR技术等，但由于基层地区的试验室缺乏相应的检测设备，同时这些技术操作要求相对较高，基层地区不具备该条件，因此通常采用传统分离鉴定方法。本次分离鉴定主要包括选择性增菌、分离培养、纯化培养、生化鉴定、糖发酵等几个步骤，准确性相对较高，采用上述步骤，能得到比较纯净的沙门氏菌菌种。 3.3致病菌耐药性鉴定

甲型副伤寒沙门氏菌是兽医临床上比较常见的沙门氏菌菌属，该种沙门氏菌具有很强的致病性，在猪群中一旦爆发流行，将会造成极大的危害，导致大量猪死亡。近年，随着生猪养殖产业不断向前发展，很多养殖户存在盲目用药的行为，抗生素的使用种类不断增多，使用量不断增大，导致致病菌的耐药性日趋严重。因此，在进行具体诊治中，在明确致病原的基础上一定要进行严格的药敏试验。本次药敏试验发现，分离得到的致病菌对头孢唑林、头孢塞酚高敏，对苯唑西林、甲氧氟啶中敏，对四环素、红霉素、氯霉素、青霉素、万古霉素低敏，对诺氟沙星耐药。因此，兽医在进行临床治疗中，一定要结合本地区药敏试验结果，选择相应的抗菌药物，这样能极大缩短发病周期，提高治疗效果。 参考文献

[1]李三星.沙门氏菌药敏试验及质粒的保有状况[J].畜牧兽医科技信息，1998（6）：7. [2]冯文喆，金菊，王盎，等.鹅沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧兽医科技信息，2018（6）：27-28.

[3]宋岱松，陈焕昌，刘媛媛，等.1例育肥猪沙门氏菌性肠炎的诊治[J].养殖与饲料，2019（5）：70-74.