实验九SOD的提取和分离

实验九⼤蒜细胞SOD的提取和分离⼀、实验⽬的

通过⼤蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋⽩质和酶的提取与分离的基本原理和操作⽅法。⼆、实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是⼀种具有抗氧化、抗衰⽼、抗辐射和消炎作⽤的药⽤酶。它可催化超氧负离⼦（O2-）进⾏歧化反应，⽣成氧和过氧化氢。⼤蒜蒜瓣和悬浮培养的⼤蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可⽤pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可⽤丙酮将其沉淀析出。

植物叶⽚在衰⽼过程中发⽣⼀系列⽣理⽣化变化，如核酸和蛋⽩质含量下降、叶绿素降解、光合作⽤降低及内源激素平衡失调等。这些指标在⼀定程度上反映衰⽼过程的变化。近来⼤量研究表明，植物在逆境胁迫或衰⽼过程中，细胞内⾃由基代谢平衡被破坏⽽有利于⾃由基的产⽣。过剩⾃由基的毒害之⼀是引发或加剧膜脂过氧化作⽤，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。⾃由基是具有未配对价电⼦的原⼦或原⼦团。⽣物体内产⽣的⾃由基主要有超氧⾃由基（O2.－）、羟⾃由基（OH.）、过氧⾃由基（ROD）、烷氧⾃由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和⾮酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏⾎酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏⾎酸（VC）、VE 和还原型⾕胱⽢肽（GSH）等是⾮酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT 等活性氧清除剂的含量⽔平和O2.－、H2O2、OH. 和O2 等活性氧的含量⽔平可作为植物衰⽼的⽣理⽣化指标。

SOD 是含⾦属辅基的酶。⾼等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD 和Cu.Zn－SOD，它们可催化下列反应：O2.－＋O2.－＋2H＋SOD → H2O2＋O2H2O2＋CAT → H2O ＋1/2O2

由于超氧⾃由基（O2.－）为不稳定⾃由基，寿命极短，测定SOD 活性⼀般为间接⽅法。并利⽤各种呈⾊反应来测定SOD 的活⼒。邻苯三酚在碱性条件下可迅速⾃氧化,释放出O2-,⽣成带⾊的中间产物，在420nm有最⼤吸收峰。邻苯三酚⾃氧化产⽣的中间产物在40s-3min 这段时间，⽣成物与时间有较好的线性关系。颜⾊深→SOD逐渐增多→颜⾊浅，即酶活⼒越⼤，颜⾊越浅。三、实验仪器、材料与试剂1、仪器

恒温⽔浴锅、冷冻⾼速离⼼机、可见分光光度计、玻璃研钵、玻棒、烧杯、量筒、精密pH试纸2、材料和试剂（1）新鲜蒜瓣

（2）A液：pH8.2，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(内含1mmol/EDTA-2Na)。称取1.2114 g Tri和37.2 mgEDTA2Na溶于62.4 ml 0.1mol/L盐酸溶液中，⽤蒸馏⽔定容⾄100ml.（缓冲液需调pH8.2）

（3）B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐溶液。称取邻苯三酚(A.R) 56.7 mg溶于少量10mmol/L 盐酸溶液，并定容到100mL.（4）10mmol/L盐酸溶液（注：常⽤的浓盐酸是37%-38%，密度为1.19g/ml, 浓盐酸摩尔浓度约11.7）

（5）0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)（⾃查，先分别配置pH7.8Na2HPO4和NaH2PO4溶液，后以适当配⽐组成)（6）氯仿-⼄醇混合液：氯仿:⽆⽔⼄醇=3:5（7）丙酮：⽤前需预冷⾄4-10℃四、实验步骤

1、组织细胞破碎：称取3g⼤蒜蒜瓣，置于预冷研钵中，加⼊少量的⽯英砂及5mL 0.05mol/L 磷酸缓冲液，冰浴上研磨成匀浆，移⼊15mL离⼼管。⽤5mL磷酸缓冲液冲洗研钵，洗涤并⼊离⼼管中，磷酸缓冲液的最终体积为10mL，全部转⼊离⼼管中，在5000rpm下离⼼15min，取上清液（提取液）。留出1ml备⽤，准确量取剩余上清液体积。

2、除杂蛋⽩：上清液加⼊0.25体积的氯仿-⼄醇混合液搅拌15min，5000rpm离⼼15min，得到的上清液为粗酶液。留出1ml备⽤，准确量取剩余上清液体积。

3、SOD的沉淀分离：粗酶液中加⼊等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离⼼15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于5mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，得到SOD酶液。留出1ml备⽤，准确量取剩余上清液体积4、SOD酶活性测定

1）将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各⾃的SOD活⼒。SOD活⼒测定加样程序见表：

2）加⼊邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4 min，加⼀滴浓盐酸停⽌反应，420nm测吸光值（OD）五、结果计算

1、酶活⼒单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1

(1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达到80%时的酶量)总活⼒U=活⼒单位×总体积⽐活⼒U/mg=活⼒单位/蛋⽩质浓度

纯化倍数=粗酶液(酶液)⽐活⼒/提取液⽐活⼒回收率=粗酶液(酶液)总活⼒/提取液总活⼒

2、根据所得结果计算出提取液、粗酶液和酶液酶活⼒单位、总活⼒、⽐活⼒、纯化倍数、回收率，并写出计算过程。注意事项

1、酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离⼼。