肝细胞再生抑制肝损伤大鼠模型的构建_陈焱

·论　　著·

肝细胞再生抑制肝损伤大鼠模型的构建

陈　焱1,陈耀凯2,王宇明2,夏　杰2

＊

(1.解放军324医院,重庆400020;2.第三军医大学西南医院感染科,重庆400038)

　　摘　要:目的　构建肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。方法　用2-乙酰氨基芴(AAF)灌喂大鼠后行肝部分切除,分时段检测肝功及肝脏再生情况。结果　本方法建立的动物模型肝再生抑制明显(P<0.01),肝功能恢复缓慢(P<0.05)。结论　肝损伤大鼠的肝细胞再生抑制明显,是较好的肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。

关键词:肝损伤;再生抑制;动物模型中图分类号:R365.575;R-332

文献标识码:A

文章编号:1671-8348(2008)15-1697-02

Animalmodelofhepatocytesanti-regenerationandliverinjury＊

CHENYan1,CHENYao-kai2,WANGYu-min2,etal.

(1.324HospitalofPLA,Chongqing400020,China;2.DepartmentofInfectiousDiseases,

SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Abstract:Objective　Toestablishtheanimalmodelofhepatocytesanti-regenerationandliverinjure.Methods　RatsweredonethepartialhepatectomyafterfeedingbyAAF.Ratsweredetectedthehepaticfunctionandregenerationofhepatocytesbyschedule.Results　AfterfeedingbyAAF,theregenerationofhepatocytesintheliverinjuryratswasobviouslyinhibited(P<0.01).There-coveryofhepaticfunctionwasslow(P<0.05).Conclusion　Thereisobviousinhibitionofhepatocyteregenerationintheliverinjurerats.Itisagoodanimalmodelofhepatocytesanti-regenerationandliverinjure.

Keywords:liverinjure;anti-regeneration;animalmodel　　肝硬化等慢性肝脏疾病是目前临床治疗的难点,进行相关疾病的研究需建立合适的动物模型,从而为临床治疗奠定实验基础。肝硬化肝脏在肝功异常同时还伴有肝细胞再生障碍,模拟持续肝功能异常并伴有肝细胞再生障碍的病理状态是作者建立本动物模型的目的。肝脏在创伤后有强大再生能力,2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,AAF)具有抑制肝细胞再生的作用,作者利用AAF的药理特性并结合外科手术,成功构建了实验性肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠模型。1　材料与方法

1.1　实验动物　清洁级SD大鼠60只(雌雄各半),6～7周龄,体质量(200±10)g,由第三军医大学动物实验中心提供。SD大鼠的饲养、麻醉、手术及术后观察均在二级清洁级动物实验室完成。SD大鼠饲养于专用不锈钢笼内,雌雄分笼喂养,恒温、通风换气、自由饮水、颗粒饲料喂养。实验室恒温(22±2)℃、恒湿(60±10)%,定时观察。1.2　方法

1.2.1　SD大鼠模型的分组　清洁级SD大鼠随机分为:实验组40只,对照组20只,均为雌雄各半。

1.2.2　肝细胞再生抑制的诱导　实验组大鼠按10mg·kg大鼠情况。对照组大鼠正常饲喂。

1.2.3　大鼠部分肝切除手术　实验第8天对实验组、对照组大鼠行肝左侧叶切除术。切除之肝脏约占全肝的1/3(3.2±0.2)g。大鼠平均手术时间约(12±3)min。术中每只大鼠出血约1mL。

-1

1.2.4　标本采集　于术后8、48h和7d分别经大鼠尾静脉抽血检测ALT、TB、血氨,了解大鼠肝功能情况。于术后第7天处死大鼠,取肝脏称重了解术后肝脏再生情况。

1.3　统计学方法　本实验研究数据均采用x±s格式。使用SPSS11.0统计软件,采用独立t检验进行数据分析处理,P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。2　结　　果

2.1　大鼠AAF灌喂后动物存活情况　实验组大鼠灌喂后普遍出现轻度腹泻,为不成形软黄便,其他无明显异常。灌喂期间大鼠死亡2只,尸检显示腹腔脏器重度黄染。灌喂后至1/3肝切除术前实验组大鼠存活率为95%(38/40)。对照组大鼠存活率为100%(20/20)。

2.2　大鼠1/3肝切除手术后存活率　实验组术后8h存活率为84.2%(32/38),术后48h存活率为71.1%(27/38),术后7d存活率为63.2%(24/38)。对照组术后8、48h和7d存活率均为80%(16/20)。

2.3　大鼠术后肝功情况及肝脏再生情况　术后按时段抽取实验组大鼠和对照组大鼠的血样标本进行肝功检测,术后7d死亡大鼠的标本检测结果予以剔除,结果见表1。

　　肝部分切除术后8h,实验组大鼠观察一般状况较差,无主动活动,无进食,且大鼠术后死亡大多发生在该阶段。术后大鼠存活超过48h则基本能够度过手术应激和急性肝损伤期,观察一般情况良好,开始进食、排便和少量活动。术后7d目测观察大鼠一般情况即正常。各时段实验组肝功各项指标与对照组有显著差异。对照组大鼠术后8h内无活动和进食,但一般

·d-1的灌喂剂量灌喂0.2%的AAF7d。灌喂期间密切观察

＊基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370391)。1698

表1　　大鼠1/3肝切除术后肝功情况

组别

n

ALT

实验组24829.8±171.2＊＊对照组16162.4±57.1　　＊:P<0.05,

8hTB9.7±2.7＊1.6±0.7

血氨136.4±40.2＊81.6±8.9

ALT

48hTB

血氨

重庆医学2008年8月第37卷第15期

7d

ALT

TB

血氨

1712.4±479.3＊4.4±1.1＊＊182.0±24.1＊＊246.6±114.3

0.8±0.2

88.6±25.5

504.4±120.2＊＊2.4±0.6＊105.6±25.030.8±6.0

0.6±0.2

51.2±4.9

＊＊:P<0.01。

情况明显较实验组好。术后存活超过48h的大鼠目测观察一般情况好,开始正常进食、排便,较实验组活跃。术后3～4d观察大鼠一般情况即正常。术后1周实验组大鼠肝脏重量为(8.92±0.16)g,对照组为(11.14±0.25)g,两组大鼠术后7d肝脏重量差异有统计学意义(P<0.01)。3　讨　　论

目前实验性肝损伤模型的构建方法主要有:化学性肝损伤、免疫性肝损伤和创伤性肝损伤。化学性肝损伤模型常用四氯化碳和D-氨基半乳糖胺(Dgalactosamine)进行模型诱导。四氯化碳进入肝细胞后,使线粒体膜的脂质溶解,自由基形成,引发链式过氧化反应,影响代谢功能和能量的生成,致使肝细胞变性、坏死[1]。但四氯化碳还同时损害动物的其他多种脏器,此外四氯化碳挥发性较大,对实验人员具有一定的危险性,使模型的应用受限。D-氨基半乳糖可致急性肝损伤[2],Kep-pler等[3]首先应用于制备大鼠肝损伤模型。经反复多次给药,D-氨基半乳糖能诱发动物产生包括纤维化过程在内的慢性肝损伤以及癌变[4]。由四氯化碳和D-氨基半乳糖等化学药物引起的经典肝损伤动物模型均属中毒性肝坏死范畴,与临床上肝硬化的病理变化有很大区别。免疫性肝损伤模型是通过生物制剂诱发肝细胞免疫性损伤,常用刀豆蛋白A诱导法、外源性蛋白致敏诱导法等。肝内免疫反应是引起肝损伤的重要机制之一,以免疫学机制诱发的肝损伤模型的建立为肝损伤的研究开辟了新的途径[5]。研究认为免疫性肝损伤造模剂作用机制是:免疫复合物有细胞毒作用,而肝小叶内的血液丰富,血流缓慢,表面积大,有利于抗原抗体的充分结合,从而引起肝细胞局限性坏死。创伤性肝损伤模型常用部分肝切除、肝血管结扎、肝外胆管结扎等方法构建。通过手术造成的肝损伤非常适合模拟肝脏外伤、肝脏解剖改变和胆汁淤积型肝硬化等。同时由于手术损伤的选择性好,损伤局限于肝脏,可以同时进行细胞移植治疗,所以肝细胞移植常应用部分肝切除的方法建模[6]。化学性或免疫性肝损伤方法建立的动物模型很难控制肝损伤程度,常常因严重的肝损伤导致实验动物存活率低。创伤性肝损伤虽可控制肝损伤程度,但难以抑制肝细胞在术后迅速再生,以目前常用的SD大鼠为例,其肝在1/3肝切除术后10d

左右,残余肝即经迅速增殖恢复正常肝体积,并重建肝小叶结构。这与临床常见的肝硬化等疾患呈现的肝细胞再生能力弱,肝功能持续异常不符。本实验采用AAF抑制肝细胞再生,部分肝切除造成肝损伤的方法建立肝再生抑制肝损伤大鼠模型,结合了化学性肝损伤造成持续性肝功能异常和创伤性肝损伤可控性好的优点。实验中AAF灌喂大鼠7d后存活率为95%,行部分肝切除术后7d存活率为63.2%。术后1周实验组与对照组大鼠肝脏质量差异有统计学意义(P<0.01),实验组与对照组大鼠肝脏功能异常差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果证实本方法获得的模型动物肝损伤确切,肝细胞再生抑制显著,同时模型动物存活率较高,是较好的肝损伤合并肝再生抑制动物模型。参考文献:[1]

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李仪奎,王钦茂.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:458.

KepplerD,LeschR,ReutterW,etal.Experimentalhepa-titisinducedbyD-galactosamine[J].ExpMolPathol,1968,9(2):279.[4][5]

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ChinzeiR,TanakaY,ShimizuSK,etal.Embryoid-bodycellsderivedfromamouseembryonicstemcelllineshowdifferentiationintofunctionalhepatocytes[J].Hepatolo-gy,2002,36(1):22.

(收稿日期:2007-11-14)

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