GelRed&GelGreen FAQ基本问答

Biotium中国区总代理 上海开放生物科技有限公司 FAQs for GelRed＆GelGreen 核心问题： Q: 关于一些客户，在预制琼脂糖凝胶中跑电泳时，marker条带跑不开，不清晰，分辨率低，拖尾等现象的解决方案。 A：基本点: 1. 拖带现象产生的一般原因：样品上样量过，marker量过多。 2. Marker分辨率低的主要原因：  marker的加样量：marker有一个推荐浓度范围，选择最高的，样品与Marker含量差别大, 也会造成条带错误（这不会是染料的问题，用EB也会存在该问题）。正确的DNA上样量是条带清晰的保证。Marker应该选择在目标片段大小附近的梯带较密的，这样比对才准确。另外注意的是，Marker的电泳条件也要符合DNA电泳的操作标准: 如果选择λDNA/EcoR I的酶切marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免Hind Ⅲ或EcoR I酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。  凝胶不平整：梳子不干净有污染，加样孔不平整也会影响图的效果；  电泳条件：电压不稳，电泳时间不超过1h。电压过高，会导致小片段跑出胶，出现条带缺失现象。  缓冲液：TBE的缓冲能力更强，如果缓冲液缓冲性能下降，会导致DNA电泳条带模糊，不规则迁移等。TAE建议换成TBE效果更好。另外建议配胶时的缓冲液和电泳缓冲液是同时配制。  染色剂：GelRed（312nm激发UV成像）无毒，性价比高，灵敏度比传统EB高10倍以上，注意观察凝胶时应根据染料不同，使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带出现模糊等情况。 PS：小片段的DNA样本，选择浓度百分比大点的gel；但是大浓度的胶对于分子大小相近的DNA条带不易分辨，容易造成条带缺失现象； 大片段的DNA样本，则选浓度百分比小点的gel，这样跑出的图分辨率高。 Marker跑不开：凝胶的浓度适当调低；电泳时间延长；电压稍微调高点。 美国技术的答案： 经过比对多家的maker产品，证实Invitrogen's 1kb Plus DNA Ladder 与Gel Red匹配度最好。 Gel Red比EB分子大（也是由于大分子特性，所以不会透过细胞膜进入人体产生伤害，染料的结合原理都是一样的）。大分子的染料在预制胶中对DNA的迁移有一定影响，但是不确定对那种类型的DNA迁移影响严重。采用后染法，不会破坏胶中的DNA样本，保证了DNA迁移的真实水平。不同于EB，你不用在对染后的胶进行脱色。 针对预制胶电泳拖带、不清晰的建议： 1. 鉴于GelRed的高灵敏性，建议减少DNA的上样量。 2. 建议把GelREed再稀释一倍后使用，但过低会影响结果的灵敏性。 3. 用1XTBE缓冲液代替TAE，因为含硼酸盐的试剂导电性能更好。 简单总结一句：如果不想改变您现有的实验条件，那就请采用电泳后染色吧！！！！！ 页1 Biotium中国区总代理 上海开放生物科技有限公司 GelRed＆GelGreen常见问题： Q: 污染或微笑的DNA条带或错误的DNA迁移条带? A: 许多客户为方便使用GelRed预制凝胶。但GelRed和GelGreen是为安全而设计的分子量较大的高效亲和型染料，在预制凝胶电泳中它们可以影响DNA的迁移。如一些限制性酶切的DNA样本，可能会在GelRed预制凝胶中异常迁移。下列建议可能会提高预制凝胶中的条带分离效果。 1． 减少DNA上样量。污染和微笑条带往往是过量的DNA样本造成的。推荐的泳道和已知浓度的样品的上样量为50-200ng/泳道。对于未知浓度的样品，尝试1/2或1/3的常用上样量 2． 减少GelRed在凝胶中的总量，比如用0.5X的浓度来代替1X的浓度。 3． 制百分比浓度小的琼脂糖凝胶。高分子量的DNA在低百分比的琼脂糖凝胶分离效果比较好。 4． 更换电泳缓冲液。 TBE缓冲液比TAE缓冲液的效果更好。 5． 为了避免染料可能对DNA迁移的干扰，我们建议使用电泳后染胶。如果跑胶程序需要的上样量超过推荐量，建议使用电泳后染色法。 Q：荧光弱，时间久染料性能降低，或使用后染法染料仍然在琼脂糖凝胶中。 A : 染料可能从溶液中沉淀。 1． 加热GelRed至45 - 50℃，2min，搅拌溶解。 2． 染料在室温下储存，以避免沉淀。 Q: 后染法需要去除染料的步骤吗？ A: 不需要，不过高背景的结果可以考虑适当脱色步骤 Q：GelRed和GelGreen可以用来染色单链DNA或RNA吗？ A: GelRed和GelGreen可用于单链DNA和RNA的染色，但GelRed染单链核酸效果比GelGreen敏感5倍左右。使用荧光酶标仪的滴定实验表明，GelRed绑定单链DNA和RNA荧光信号约是结合双链DNA的一半左右。 Q：用那些仪器检测GelRed和GelGreen？ A: GelRed完美兼容标准（302或312nm）紫外透射成像仪。 GelGreen的吸光度在250-300 nm和吸收峰在500纳米左右。GelGreen兼容254 nm的紫外透射或可见光激发的凝胶成像仪，如Dark Reader或488 nm凝胶激光扫描仪。 Q：什么样的发射滤波片适合使用GelRed和GelGreen？ A: GelRed使用溴化乙锭滤片; GelGreen使用SYBR Green或黄色滤片。另外，长通道黄色滤片可用于GelRed或GelGreen。请查阅GelRed和GelGreen更多的特定波长的发射光谱。 Q: 可以提前制作GelRed / GelGreen凝胶，储存供以后使用吗？ A: GelRed和GelGreen染料是稳定的。在保证琼脂糖凝胶的完整性不会被破坏的前提下，你可以将预制的GelRed / GelGreen凝胶储存供以后使用。我们建议在4℃避光贮存凝胶。 Q：GelRed / GelGreen在熔化的琼脂糖中稳定么？可以将GelRed / GelGreen储存在熔化的琼页2 Biotium中国区总代理 上海开放生物科技有限公司 脂糖胶中，到用的时候在制备凝胶吗？ A: GelRed比GelGreen更加稳定。但我们不建议将GelRed放在熔化的琼脂糖中存放几天。 Q: GelRed /GelGreen的预制凝胶可以重复使用吗？ A: 不可以，我们不建议GelRed / GelGreen凝胶电泳后重复使用，因为连续电泳会减少染色强度。 Q: 可以重新融化GelRed / GelGreen凝胶，再制备吗？ A: 是的，但最好再添加一些染料，保证重新制备凝胶的信号强度。 Q：GelRed和GelGreen用后应该如何处置？ A: GelRed和GelGreen通过EPA环保监管局22个指标测试。GelRed和GelGreen已经被相关部门批准，可以直接倾倒入下水道。然而，由于地方规定的差异，您可以请联系您当地的安全监管部门，获取相关条例。详情请查阅GelRed / GelGreen安全报告信息。 Q: GelRed及GelGreen与如克隆，连接和测序的下游扩增子兼容吗？ A: 可以。我们建议使用Qiagen公司或Zymoclean凝胶提取试剂盒，EXO-SAP方案，或酚氯仿抽提法去除DNA中的染料成分。由于GelRed/GelGreen与DNA结合比EB更为紧密，所以需要去除样品DNA中的GelRed/GelGreen染料,保证DNA的后续操作。 Q: GelRed / GelGreen安全性如何？ A: GelRed/ GelGreen经过埃姆斯AMS和相关测试，已经被证明是替代EB和SYBR染料更为安全的产品。不过，请使用这些试剂时，也要遵循实验室安全条例等。 Q: 哪里可以找到GelRed / GelGreen安全性相关信息？ A: 请访问我们的网站www.biotium.com下载完整的安全报告。 Q: GelRed / GelGreen检测下限是什么？ A: GelRed/ GelGreen是超敏感的染料。有些用户反馈可以检测含量＜0.1ng的DNA。然而，染色的灵敏度取决于仪器的性能和曝光设置等。 Q: GelRed / GelGreen的结合机制是什么？ A: GelRed/ GelGreen作用原理通过静电及电荷相互作用的结合。 Q: GelRed / GelGreen迁移的方向？ A: GelRed和GelGreen相比于EB来说，不容易通过凝胶迁移。不需要在电泳缓冲液中添加额外的染料，凝胶也会比EB染色更均匀。 Q: GelRed/ GelGreen需要在黑暗中使用吗？ A: GelRed和GelGreen是稳定的染料。你可以在室内光线下使用。然而，我们建议将染料储存于黑暗中。 Q: GelRed / GelGreen的使用量？ A: 10,000×储备液用于1X预制凝胶使用量1:10000（例如，5 uL用于50ml凝胶），或1:3333比例用于电泳后染色（15 uL用于50 mL溶液）。 页3 Biotium中国区总代理 上海开放生物科技有限公司 Q: GelRed / GelGreen电泳后染色可重复使用吗？ A: 可以。但，如果敏感度降低，则建议更换新鲜的染料溶液。 Q: GelRed可以被用于凝胶迁移电泳分析和脉冲凝胶电泳吗？ A: 可以。GelRed可用于EMSA和PFGE凝胶的电泳后染色。 Q: GelRed / GelGreen可以被用于Southern或Northern杂交吗？它会干扰转膜或杂交过程吗？ A: GelRed可被用于Southern杂交（植物细胞报告DOI：10.1007/s00299-011-1150-7）。我们建议使用后染法。 Q: GelRed可以被用于基于甲醛的RNA凝胶中？ A: 可以。 Q: GelRed可以被用于聚丙烯酰胺，DGGE技术，EMSA实验或PFGE（脉冲场）凝胶吗？ A: 可以。请使后染法。 Q: GelRed可以被用于彗星试验(单细胞凝胶电泳测定技术，它是一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法)？ A: 是。 Q: GelRed是否用于碱性凝胶电泳缓冲液（30MM的NaOH，1mM的EDTA）？ A: 是。 Q: GelRed可被用于氯化铯梯度纯化的DNA染色吗？ A: 客户使用的结果显示可以。为了去除氯化铯梯度纯化的DNA中的GelRed，我们建议正丁醇萃取前添加SDS至终浓度0.1％。 Q: 建议用什么方案去除电泳后胶中的GelGreen / GelRed染料？ A: 客户报告中提到使用Zymo Research公司的ZymoClean凝胶DNA回收试剂盒，USB/Affymetrix公司的ExoSap-It 试剂盒、Sigma的GenElute琼脂糖柱。Life Technologies 公司的PureLink快速凝胶回收试剂盒，GE Healthcare公司的Illustra GFX PCR DNA 和凝胶条带纯化试剂盒、Roche 应用科学公司的高纯度PCR产物纯化试剂盒。 Q: 为什么有GelRed和GelGreen两种溶剂（二甲基亚砜DMSO和水）？在DMSO和水中的染料是否存在差异？ A: 水溶解的产品相对于储存在DMSO中，是一个全新的改良。由于DMSO会被皮肤吸收，我们建议染料溶于水，以避免处理二甲基亚砜存在的潜在危害。鉴于有些用户不希望改变实验方案，我们将继续提供储存在DMSO的染料。经过内部测试，两种溶剂方案的效果相似。 页4