3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

【论著】

3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立

蔡亦红,姚余有

(安徽医科大学,合肥　230032)

[摘要]　目的:建立快速检测食源性致病菌的多重PCR方法。方法:本研究根据肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素(Heatlabileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)的侵袭蛋

白A(invasionproteinA,invA)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigenH,ipaH),分

别设计了三对引物,预计PCR扩增的目的基因片段为194、279和435bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异

3

性、敏感性分析以及建立L16(4)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测肠毒性大肠埃希菌、伤寒沙门菌和福氏志贺菌的稳定的单管多重PCR方法。结果:该方法检测的灵敏度分别为:145pg/ml肠毒性大肠埃希菌的基因组DNA、100ng/ml伤寒沙门菌的基因组DNA、7ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA,与单基因PCR检测的灵敏度相同。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。结论:该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控。[关键词]　多重PCR;食品检验;肠毒性大肠埃希菌;伤寒沙门菌;福氏志贺菌

[中图分类号]　R15515　　　　[文献标识码]　A　　　　[文章编号]　1004-8685(2007)11-1959-04

EstablishmentandapplicationofmultiplePCRfordiagnosingthreefood-bornebacteri2alpathogens

CaiYi2hong,YaoYu2you

(AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

[Abstract]　Objective:ToestablishandapplymultiplePCRfordiagnosingthreefood-bornebacterialpathogens1Methods:ThreepairsofprimershavebeendesignedaccordingtotheEnterotoxigenicE1coli(ETEC)heatlabileenterotoxinB(LTB),Salmo2nellatyphiinvasionproteinA(invA),ShigellaflexneriinvasionplasmidantigenH(ipaH)1AnticipatedPCRproductwas194,279and435bp1ThespecificityandsensitivityofPCRwereanalyzedforsinglegene1MultiplePCRmethodhasbeendevelopedfordi2agnosingETEC,Salmonellatyphi,Shigellaflexneriafteranalysisandoptimizationreactionconditionbyorthogonalexperimental

3

designL16(4)1Results:ThesensitivityofmultiplePCRwas145pg/mlgenomeDNAforETEC,100ng/mlforSalmonellatyphi,7ng/mlforShigellaflexneri,whicharesameasthesensitivityofsinglePCR1Theresultswerestableinsimulatedexamination.Conclusion:ThemultiplePCRmethodisvaluableforexplorationandappliacation1

[Keywords]　MultiplePCR;Foodinspection;EnterotoxigenicE1coli;Salmonellatyphi;Shigellaflexneri

　　近年来,随着经济全球化进程的加快,食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因,食源性致病菌对人类健康造成极大危害,是食品安全的重大隐患。据WHO估计,发达国家每年约30%的人口患食源性疾病[1],在发展中国家情况更为严重,估计每年腹泻及其相关疾病有217亿病例,导致240万5岁以下儿童死亡[2]。食源性疾病可以侵犯任何人群,儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病,成为最主要的受害人群[3]。

肠毒性大肠埃希菌(enterotoxigenicE1coli,ETEC),伤寒沙门菌(Salmonellatyphi),福氏志贺菌(Shigellaflexneri)是引起食源性疾病的常见3种病原体[4]。这3种病原体感染人体都

[基金项目]　安徽医科大学校科研基金资助项目(522562)[作者简介]　蔡亦红(1980-),女,硕士,助教,主要从事卫生微

生物学研究。

会出现恶心、呕吐、腹痛等相似的症状,尤其是症状不典型者,

极容易被相互误诊,影响治疗而导致慢性感染或带菌者。因此,迫切需要对这3种病原体进行准确而快速的诊断。目前包括我国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多仍沿用传统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法,检验步骤繁琐,检验周期较长,而且检测的灵敏度也较低。尤其是在应对突发公共卫生事件上,不能够满足诊断及时、结果准确、敏感性和特异性高的要求[5]。

鉴于此,为了能够更快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控,本研究将以肠毒性大肠埃希菌的编码大肠杆菌不耐热毒素(Heatlabileenterotoxin,LT)的B亚单位(LTB)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)的侵袭蛋白A(invasionproteinA,invA)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigenH,ipaH)作为研究对象,建立一种稳定的、高敏感性和特异性的多重PCR体系,对快速、准确的一次性检测食品中3种病原体感染状况进行探讨。

19601　材料与方法111　菌种

中国卫生检验杂志2007年11月第17卷第11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17　No11

液3μl,其余用去离子水补足,总体积50μl。扩增条件同上。

117　单管多重PCR的扩增条件优化

金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、伤寒沙门菌、福氏志贺菌、肠毒性大肠埃希菌由安徽医科大学微生物教研室和安徽省合肥市疾病预防控制中心提供。112　主要试剂及仪器

PCR扩增试剂购自上海Promega公司、DNA提取试剂盒购自上海赛百盛基因技术公司、100bpDNAladdermarker购自Takara宝生物工程(大连)有限公司、751型紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司、DYY-5型电泳仪由北京市六一仪器厂生产、Mastercycler梯度PCR仪购自Eppendorf公司。113　细菌的培养和基因组DNA的提取

将肠毒性大肠埃希菌接种于肠道菌增菌肉汤、沙门菌接种于SC增菌液、志贺菌接种于GN增菌液[6]中进行增菌,然后接种于EMB培养基上进行纯培养。挑一单个菌落复接种到30ml相应增菌液内增菌,提取1ml菌液用甘油保存于-80℃备用。其余菌液与培养有金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌的培养液分装于离心管中,5000r/min离心1min,收集沉淀,用细菌DNA提取试剂盒提取3种细菌的DNA,用紫外分光光度计测定DNA浓度,分装数管,-20℃保存备用。肠毒性大肠埃希菌基因浓度为145μg/ml,沙门菌基因浓度为100μg/ml,志贺菌基因浓度为70μg/ml。114　扩增的目的基因及引物设计

以肠毒性大肠埃希菌的编码LTB的基因,沙门菌的invA基因,志贺菌的ipaH基因为研究对象,根据Genbank中基因序列,应用Primer510引物设计软件设计如下三对特异性引物(表1)。

表1　多重PCR扩增的目的基因名称及序列号及引物设计

菌种

目的

NCBI

)引物序列(5′-3′

对影响多重PCR扩增条件如dNTP浓度、退火温度和引物浓度等进行优化,以确定最佳的PCR反应条件。通过单基因敏感度试验初步摸索出最佳模板浓度,根据多次试验和经验,对影响较大的因素:引物浓度、dNTP浓度和Tm值先初步

确定了一定的范围,然后设计了一个L16(43)的正交试验。

118　单管多重PCR的特异性和敏感性分析

11811　特异性试验　为进一步验证本实验设计的多重PCR

的特异性,分别以3种标准菌株提取的单一DNA为模板,同时加入3对引物进行扩增;再以3种标准菌株提取的混合DNA为模板,分别加入单对引物扩增。

11812　敏感性试验　将已经测定浓度的3种细菌的模板DNA按10～100

-10

梯度进行10倍稀释后分别混合,按已优化

的多重PCR反应条件分别进行PCR扩增,测定多重PCR扩增的敏感性。119　人工模拟样品检测将3种菌培养液任意2种、3种等量混合,计算菌落总数,使每种菌的含量>104cfu/ml,接种于3种菌为阴性的2g生鸡蛋、奶粉、碎猪肉中培养一段时间后,取样品进行多重PCR检测。

2　结果

211　肠毒性大肠埃希菌的编码LTB的基因,沙门菌的invA基

因,志贺菌的ipaH基因的PCR扩增和核苷酸序列分析将金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌菌液等量分别与3种目的菌液混合后利用试剂盒提取模板DNA,用编码

LTB基因的引物进行PCR,结果只有在含有肠毒性大肠埃希

菌的模板中扩增出大小约为194bp的特异性片段(图1A);用

扩增长度

194bp279bp

invA基因的引物进行PCR,结果只有在含有沙门菌的模板中

基因注册号

扩增出大小约为279bp的特异性片段(图1B);用ipaH的引物进行PCR,结果只有在含有志贺菌的模板中扩增出大小约为435bp的特异性片段(图1C)。对照菌模板中均未扩增出目的基因。扩增的编码LTB的基因片段、invA基因片段和

ipaH基因片段与GenBank中公布的基因序列同源性均达到98%以上。

肠毒性大肠埃希菌LTBNC002128CTGGTAGTGTCTCGGGTGTGTGGTAGCTTGAGCGGTG沙门菌福氏志贺菌

invANC004631AAGAAGCGTCATCGTTAGTCACGACTCGTATCACAT

ipaHNC008258GCGGGCATAGTGAACATAAAGCGGTAAGACGTTCAACAC435bp

115　单基因PCR扩增及特异性和敏感性分析

先对3种菌进行单独扩增,反应体系:模板DNA1μl,上、下游引物各1μl(10pmol/L),dNTP115μl(215mmol/L),Taq

μl),10×酶015μl(单位为5U/Taq酶buffer215μl,MgCl2溶

液115μl,其余用无菌的去离子水补足,总体积25μl。PCR扩增条件:95℃变性3min,94℃变性50s、54℃退火50s、72℃延伸50s,共进行30个循环,最后72℃延伸10min,PCR产物在115%的凝胶上进行电泳。将3个PCR扩增产物进行回收,然后进行核苷酸序列测定,并与Genbank中发表的相应序列进行比较。

将已经测定浓度的3种细菌的模板DNA按100～10-10倍稀释,按照相同的上述条件分别进行PCR扩增,测定单基因

PCR扩增的敏感性。

116　单管多重PCR的扩增反应体系

图1　肠毒性大肠埃希菌的编码LTB的基因(A),沙门菌的invA基因(B),志贺菌的ipaH基因(C)的PCR扩增结果图1A泳道1:ETEC;泳道2:沙门菌、福氏志贺菌;泳道3:金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌;泳道4:100bp

DNAladdermarker;图1B泳道1:ETEC、福氏志贺菌;泳道2:

沙门菌;泳道3:金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌;泳道4:100bpDNAladdermarker;图1C泳道1:ETEC、沙门菌;泳道2:金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌;泳道3:福氏志贺菌;泳道4:100bpDNAladdermarker

模板DNA3μl(3种菌各1μl),引物3μl(3种引物各1μl),dNTP共3μl,Taq酶1μl,10×Taq酶buffer5μl,MgCl2溶

中国卫生检验杂志2007年11月第17卷第11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17　No111961

212　单基因PCR扩增的敏感性分析

PCR检测肠毒性大肠埃希菌的灵敏度达到了145pg/ml(图2A),PCR检测沙门菌的灵敏度达到了100ng/ml(图2B),而PCR检测志贺菌的灵敏度为7ng/ml(图2C)。

图3　ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌单管多重PCR

初步检测结果(A)和条件优化后检测结果(B)图3A泳道1:ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌单管多重

PCR结果;泳道2:100bpDNAladdermarker;

图3B泳道1:ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌单管多重PCR

条件优化后结果;泳道2:100bpDNAladdermarker

214　单管多重PCR的特异性检测结果分别以ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌提取的单一DNA为模板,同时加入3对引物进行扩增;再以3种细菌提取的混合DNA为模板,分别加入单对引物扩增。结果显示分别可以在194、279、435bp处出现明显的目的条带,并且无非特异性条带和引物二聚体的形成(图4A、B)。

图2　ETECPCR灵敏度检测(A)、伤寒沙门菌PCR灵敏度检测(B)和福氏志贺菌PCR灵敏度检测结果(C)图2A泳道1:1415fg/ml;泳道2:145fg/ml;泳道3:1145pg/ml;泳道4:1415pg/ml;泳道5:145pg/ml;泳道6:1145ng/ml;

泳道7:1415ng/ml;泳道8:145ng/ml;泳道9:1145μg/ml;泳道10:1415μg/ml;泳道11:145μg/ml;泳道12:100bp

DNAladdermarker;图2B泳道1:10fg/ml;泳道2:100fg/ml;

图4　ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌单管多重

PCR的特异性检测结果

图4A泳道1:模板为ETEC同时加入三对引物;泳道2:模板为福氏志贺菌同时加入三对引物;泳道3:模板为沙门菌同时加入三对引物;泳道4:100bpDNAladdermarker;图4B泳道1:

3种菌混合模板加入编码LTB基因引物;泳道2:3种菌

泳道3:1pg/ml;泳道4:10pg/ml;泳道5:100pg/ml;泳道6:1ng/ml;泳道7:10ng/ml;泳道8:100ng/ml;

泳道9:1μg/ml;泳道10:10μg/ml;泳道11:100μg/ml;泳道12:100bpDNAladdermarker;图2C泳道1:7fg/ml;泳道2:70fg/ml;泳道3:017pg/ml;泳道4:7pg/ml;泳道5:70pg/ml;泳道6:017ng/ml;泳道7:7ng/ml;泳道8:70ng/ml;泳道9:017μg/ml;泳道10:7μg/ml;泳道11:70μg/ml;泳道12:100bpDNAladdermarker

混合模板加入ipaH基因引物;泳道3:3种菌混合模板加入invA基因引物;泳道4:100bpDNAladdermarker

215　单管多重PCR的敏感性试验

多重PCR中最低能检测到反应体系中145pg/mlETEC的DNA,100ng/ml沙门菌的DNA,7ng/ml福氏志贺菌的DNA(图5)。

213　单管多重PCR的扩增及其条件的优化

初步条件下在同一试管中同时扩增3种目的基因片段,结果在194、279、435bp处出现三条明显的平行条带(图3A)。接下来,对扩增的条件进一步优化。对影响较大的因素:引物

3

浓度、dNTP浓度和Tm值,分别设计在一定范围内的L16(4)正交试验。根据Bandscan510软件分析图像灰度值,并以100bpDNAladdermarker中500bp处条带的灰度值与DNA含量的比值为标准,计算扩增的目的基因片段的相对表达水平。结果显示50μl的PCR反应体系中的其他影响较小的因素不变:Taq酶1μl,10×Taq酶buffer5μl,MgCl2溶液3μl。

μl,最适dNTP浓度为最适引物浓度为014pmol/

μl,最适Tm值为52℃(图3B)。0125μmol/

图5　ETEC、伤寒沙门菌和福氏志贺菌单管多重PCR的敏感性检测结果

泳道1:10

-10

;泳道2:10-9;泳道3:10-8;泳道4:10-9;泳道5:10-6;

泳道6:10-5;泳道7:10-4;泳道8:10-3;泳道9:10-2;泳道10:10-1;泳道11:100;泳道12:100bpDNAladdermarker

1962中国卫生检验杂志2007年11月第17卷第11期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2007;Vol17　No11

216　人工模拟样品检测

将3种菌培养液任意2种、3种等量混合,使每种菌的含量4

>10cfu/ml,接种于3种菌为阴性的2g生鸡蛋、奶粉、碎猪肉中培养一段时间后,取样品进行多重PCR检测。实验证明人工污染的食品中都可以同时的准确地检测出所接种的致病菌,并且无非特异性扩增,证明该多重PCR检测方法对食品中存在的ETEC、沙门菌和福氏志贺菌有很好的特异性和敏感性。3　讨论

近年来,多种单一致病菌的PCR快速检验方法被建立起来,如沙门菌[7]、单核细胞增生性李斯特氏菌[8]、大肠杆菌

[9]

O157等。然而在食品生产和流通中,企业和政府监管部门均需对大批食品进行致病菌的检测,样本量大、时间急,单一致病菌的PCR检测技术和一般方法显然不能满足这些部门不断发展的需要。针对这种情况两种或多种致病菌的多重PCR已在很大程度建立起来。多重PCR技术具有高效、高产、低成本、速度快等优点,目前已在多种病原微生物的检测中得到了初步的应用[10],是食源性致病菌快速检测技术的重要开发方向。本研究中选取的肠毒性大肠埃希菌基因组中编码LTB的基因片段作为检测的目的基因。LTB是由肠毒性大肠埃希菌分泌的主要外毒素大肠杆菌不耐热毒素(Heatlabileenterotox2in,LT)的B亚单位(LTB)组成。编码LTB的基因常作为基因检测和鉴定的依据[11～13]。沙门菌菌体的侵袭蛋白决定其侵袭力,其中invA基因编码的侵袭蛋白A是吸附和侵袭上皮细胞的表面抗原,在细菌的致病过程中起着重要作用[14]。Boyd等对19株肠炎沙门菌invA基因进行多态性分析得出invA与看家基因有相当的保守性[15]。invA基因有可能是沙门菌的主要特征区域,是一段只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列[16],可作为基因检测和鉴定的依据[17]。有研究证明以invA基因为目的基因检测沙门菌的特异性和准确性高达

[18]

9715%,准确性达100%。志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(invasionplasmidantigenH,ipaH)是编码侵袭性质粒的基因,存在于所有志贺菌属的质粒和染色体上,有大量的拷贝数,基因具有高度特异性,比其他毒力因子ipaB、C、D基因有更高的

[19]

灵敏度,是侵袭力的特异标志。赵丽华等以ipaH基因为目的基因,利用分子信标PCR的方法检测20份样本,准确率和特异性均为100%[20]。

多重PCR的影响因素复杂,不同的引物之间、模板和引物

2+

浓度及其比例、dNTP的浓度、Tm值的大小、Mg的浓度等都会对PCR结果造成不同程度的影响。通过本研究表明,对扩增结果影响较大的是模板浓度、引物浓度、dNTP浓度和Tm值。不同的模板浓度会影响产物量的多少,本研究中多重PCR最低能检测到反应体系中145pg/mlETEC的DNA,100ng/ml沙门菌的DNA,7ng/ml福氏志贺菌的DNA,这与单基因PCR中检测的最低DNA浓度相同。随着模板浓度的提高可以明显的看到产物条带亮度明显提高。对引物浓度、

3

dNTP浓度和Tm值,分别设计在一定范围内的L16(4)正交试验。根据Bandscan510软件分析图像灰度值,并以100bpDNAladdermarker中500bp处条带的灰度值与DNA含量的比值为标准,计算扩增的目的基因片段的相对表达水平。再通过方差分析,结果显示在这三个因素中,引物浓度对PCR扩增结果的影响明显大于dNTP和Tm值。以100bpDNAladdermarker中500bp的DNA片段含有DNA量为150ng,优化后多重PCR扩增后的三条平行的条带的平均DNA量为353126ng,并且无非特异性条带和引物二聚体的产生。在优化的过程中,我们还发现虽然在其他条件下多重PCR扩增后

的条带的平均DNA量也能达到355156ng,但是此时在700bp和1200bp处有非特异性条带的出现。

本试验通过对3种食源性致病菌的特异性基因片段的选择、多重PCR体系的建立和优化,可同时扩增出3种细菌。此方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控,尤其在应对突发公共卫生事件中发挥着重要作用。

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(收稿日期:2007-07-16)