怎样根据mRNA设计引物?
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热心网友
先找到基因的mrnax序列。
引物设计参数：
a
引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度，不同软件tm使用不同的算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以设置在55-58度，beacon
design可以设置在65左右。
c
gc含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响pcr扩增。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后，在ncbi上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。
热心网友
mRNA序列和cDNA序列基本一致，只是T、U的对应。
引物设计是根据cDNA的两端序列，上游引物与cDNA的5‘端相同，下游引物与cDNA的3’反向互补序列相同，即与cDNA的互补序列的5‘端相同。cDNA的序列你在pubmed的网站可以找到（CDs那一项）。
具体几个碱基，一般是15~18个就差不多了，尽量保证上下游引物的GC含量一致。这样PCR的时候，引物结合的效率是一致的，PCR成功的几率更高。
另外，如果要做克隆质粒的实验，当然需要加入酶切序列啦！酶切位点的选择也有几点要注意的，你需要的话我再详细说啊！
