同源重组 Red/ET是什么技术?
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发布时间：2024-10-24 06:39
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时间：2024-11-07 04:46
Red/ET同源重组技术，基于短同源臂（40-50 bp）的同源重组，利用大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对Redα/Redβ或Rac原噬菌体的蛋白对RecE/RecT介导，对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。
1998年，Zhang等发现大肠杆菌Rac原噬菌体上的recE/recT编码的蛋白能高效介导体内同源重组，而Muyers等发现来自大肠杆菌λ噬菌体的Redα/Redβ蛋白与RecE/RecT蛋白有类似功能。Stewart等将这两个重组酶体系合并命名为“Red/ET重组工程”。相比体内自然发生的同源重组，Red/ET只需要40-50 bp同源臂即可高效重组，突破了酶切位点和长片段PCR扩增的局限性。通过合成引物在PCR产物两端添加短同源臂，可与任意位置的目标序列进行同源重组。Red/ET操作在大肠杆菌中完成，缩短了构建载体和基因修饰步骤，广泛应用于基因操作。
Red/ET结合反向筛选技术，可用于DNA无痕敲除、定点突变和模块替换等修饰。基于噬菌体蛋白的同源重组系统广泛应用于细菌基因修饰，不仅在大肠杆菌中高效，同样适用于多种细菌。Red/ET仅在部分与大肠杆菌亲缘关系较近的革兰氏阴性菌中应用，而在较远菌类中功能受限。但Red/ET的建立为在其他细菌基因组中寻找重组酶提供了理论依据和技术指导。例如，Kessel等采用来自革兰氏阳性细菌耻垢分枝杆菌的Redα/β类似蛋白构建了特异性重组工程系统，能在该细菌中高效进行单链重组。Pijkeren等在罗伊氏乳杆菌中发现与recT同源的基因，编码蛋白能在乳酸杆菌中有效介导单链重组。
Red/ET技术还能免建库直接克隆大型基因簇，促进了微生物次级代谢产物的异源表达研究。不仅可以精确修饰大肠杆菌DNA分子的任意位置，包括单碱基改变和基因的插入与删除，还能在多个其他细菌中工作。未来，将继续发现新的宿主特异性重组酶，建立更多高效遗传操作体系，推动微生物功能基因组和基因组挖掘的发展。以全长RecET介导的线线重组为基础的免建库直接克隆技术为大片段基因簇研究奠定基础，加速后基因组时代以异源表达为策略的微生物次级代谢产物的发现和开发。随着分子生物学和基因工程技术的发展，Red/ET技术不断进步和完善，已成为基因功能研究中的一项热门技术，在基因组学研究和微生物基因组功能挖掘中扮演重要角色。
