如何用注射器卡盒在酶标仪上进行双荧光素酶报告基因实验(DLR)_百度知 ...
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发布时间：2024-10-24 15:52
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时间：2024-11-16 18:37
双报告基因实验(DLR)是研究真核生物基因表达的有力工具。实验涉及将两种质粒共转染细胞，一种包含目的基因的启动子，另一种包含质控基因的启动子。萤火虫和海肾荧光素酶的生物发光报告系统因其易操作性和高灵敏度而广泛应用，Promega公司的双报告基因实验系统允许在单个微孔板孔中同时检测两种酶的活性。实验流程简便，无需额外处理，易于在SpectraMax i3x多功能酶标仪的注射器卡盒上完成。
实验所需材料包括双报告基因实验系统、CHO-K1细胞、Fugene高效转染试剂、6孔组织培养板、96孔平底底透白色TC处理板、光学放大的封膜、白色96和384孔微孔板、SpectraMax i3x多功能微孔板读板机和SpectraMax注射器卡盒。实验方法分为酶标准曲线和基于细胞的实验两部分。酶标准曲线通过配制萤火虫和海肾荧光素酶的工作液和标准品进行，同时准备双荧光素酶检测试剂，用于冲洗注射器卡盒并进行加液操作。
基于细胞的实验中，将CHO-K1细胞接种于6孔板并在隔夜培养，接着进行瞬转pGL4.13 [luc2/SV40] 和 pGL4.74 [hRluc/TK] 质粒，然后将细胞转移到96孔平底底透白色TC处理板中，调整细胞密度，进行裂解，并结合双荧光素酶报告实验系统和SpectraMax i3x读板机的注射器卡盒进行实验。实验前，使用白色封膜提高检测信号。
实验结果显示，萤火虫和海肾荧光素酶的信号均能达到6个数量级的动态范围，从1.6 fM到1.6 nM，96孔板的检测范围为1 fg每孔到1 ng每孔，384孔板为0.5 fg到0.5 ng每孔。这两种系统展现出稳定性和相似的线性度，表明双荧光素酶系统与SpectraMax i3x系统相兼容。
实验进一步验证了萤火虫和海肾荧光素酶在不同细胞密度下的线性度，结果显示，两种酶的化学发光信号差异源于转染细胞中萤火虫与海肾质粒的比例和启动子能力的差异。通过将萤火虫荧光素酶RLU值均一化到海肾荧光素酶RLU值，实验结果在不同细胞密度梯度中保持一致。
综上所述，双报告基因实验系统和SpectraMax i3x系统的结合提供了高度敏感性和动态范围的检测能力，即使在荧光素酶表达量和细胞密度存在显著差异的情况下，仍能准确检测荧光素酶信号。SpectraMax i3x多功能微孔板读板机的制冷PMT检测器可以有效降低背景信号，提高实验灵敏度和动态范围。通过SoftMax Pro软件预设的模板进行快速分析和结果均一化，使得数据分析变得便捷。
