westernblot的原理是什么?
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发布时间：20小时前
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时间：18小时前
Western blot是一种蛋白质免疫印迹试验，其原理在于抗原与抗体的特异性结合。电泳将蛋白分离后，转移至PVDF膜上，形成抗原-抗体复合物，抗体通过共价键吸附于膜上，作为抗原的检测工具。二抗作为显色标记，通过底物显色反应揭示组织和细胞中的蛋白表达情况。
在提取蛋白质时，组织和细胞的处理方式不同。组织提取需要进行预实验以确定最佳的提取条件，如离心力、时间等，以去除干扰因素，如血液、脂肪等。细胞提取相对简单，对于贴壁细胞，需先清洗去除培养基，加入RIPA裂解液，通过离心分离提取蛋白；悬浮细胞则需进行离心后，加入RIPA裂解液进行提取。提取全程需保持低温状态，以防止蛋白降解。
蛋白质浓度的测定通常采用BCA法，其原理是BCA工作液与铜离子结合形成稳定的紫色复合物，通过562nm波长下吸光度的测量，制作标准曲线，从而计算出蛋白浓度。
蛋白质变性通过加入1*loading buffer煮沸5分钟实现，此过程破坏蛋白质与其它物质间的非共价键，形成带负电的复合物，便于电泳分离。电泳时，选择不同浓度的分离胶（8%、12%、15%）以适应不同分子量的蛋白质。电泳条件通常为80V、300mA跑浓缩胶，120V、300mA跑分离胶，恒压电泳。
转膜分为湿转和干转，湿转效果更佳，适用于大分子和小分子蛋白的转移。转膜条件为220V、300mA，转膜时间1小时20分钟，可适用于10-180kDa分子量的蛋白。
发光使用ECL发光液，通过过氧化氢和HRP氧化鲁米诺产生荧光，增强剂提高发光效果。发光液的新鲜程度、一抗二抗浓度等影响发光效果。处理条带时，可利用Photoshop调整对比度，减少后续图像分析的干扰。ImageJ软件则用于测量蛋白灰度值。
Western blot的分析包括软件处理，如Photoshop调整条带对比度，以及使用ImageJ测量灰度值。BCA法测定的蛋白浓度可能有误差，可通过内参灰度值进行校正，调整各组上样量。
